脂肪酶（LPS）测定试剂盒（微量法）

自备仪器和用品：                                                     

研钵、台式离心机、震荡混匀器、可见分光光度计/酶标仪、微量石英比色皿/96孔板、可调式移液枪、甲苯80mL、冰和蒸馏水。

试剂组成和配制：                                                    

试剂一：液体65mL×2瓶，4℃保存。

试剂二：液体10mL×1瓶，4℃保存。每次使用前用震荡混匀器剧烈震荡20min。

试剂三：甲苯80mL×1瓶，4℃保存（自备）。

试剂四：液体10mL×1瓶，4℃保存。

标准品：液体10 μL×1瓶，10 µmol/mL的标准溶液，4℃保存。临用前加入3.168 mL甲苯，充分溶解。

粗酶液提取：                                                           

1.       组织：按照组织质量（g）：试剂一体积(mL)为1：5~10的比例（建议称取约0.1g组织，加入1mL试剂一）进行冰浴匀浆。12000g，4℃离心10min，取上清置冰上待测。

2.       细菌、真菌：按照细胞数量（10⁴个）：试剂一体积（mL）为500~1000：1的比例（建议500万细胞加入1mL试剂一），冰浴超声波破碎细胞（功率300w，超声3秒，间隔7秒，总时间3min）；然后12000g，4℃，离心10min，取上清置于冰上待测。

3.       血清等液体: 直接检测。

LPS测定操作：                                                         

1.       分光光度计/酶标仪预热30 min，调节波长到710 nm，蒸馏水调零。

2.       试剂一和试剂二置于37℃水浴预热30min。

3.       在1.5mL EP管中依次加入下列试剂

37℃振荡反应10 min

37℃振荡反应10 min后，8000g，25℃，离心10min，取上清液

37℃振荡反应5 min后，静置5min，取200μL上层液加入微量石英比色皿/96孔板，于710nm处测定吸光值。

注意：空白管和标准管只需测定一次。

LPS活性计算公式：                                                    

1. 组织、细菌或细胞LPS活性

（1）按照蛋白浓度计算

活性单位定义：37℃中每毫克蛋白每分钟水解橄榄油生成1μmol脂肪酸为一个酶活单位。

LPS (μmol/min/mg prot) = [C标准品×(A测定管-A空白管)÷（A标准- A空白管）]×V反总÷（Cpr×V样）÷T

=16×[(A测定管－A空白管)÷（A标准管- A空白管）]÷Cpr

（2）按照样本质量计算

活性单位定义：37℃中每克组织每分钟水解橄榄油生成1μmol脂肪酸为一个酶活单位。

LPS (μmol/min/g 鲜重) = [C标准品×(A测定管-A空白管)÷（A标准管- A空白管）]×V反总÷（W×V样÷V样总）÷T

=16×[(A测定管－A空白管)÷（A标准管- A空白管）]÷W

（3）按照细菌或者细胞数量计算

活性单位定义：37℃中每10⁴个细胞每分钟水解橄榄油生成1μmol脂肪酸为一个酶活单位。

LPS (μmol /min/10⁴cell) = [C标准品×(A测定管-A空白管)÷（A标准管- A空白管）]×V反总÷（细胞数量×V样÷V样总）÷T

=16×[(A测定管－A空白管)÷（A标准管- A空白管）]÷细胞数量

2. 血清等液体LPS活性

活性单位定义：37℃中每毫升血清每分钟水解橄榄油生成1μmol脂肪酸为一个酶活单位。

LPS (μmol /min/mL) = [C标准品×(A测定管－A空白管)÷（A标准管- A空白管）]×V反总÷V样÷T

=16×[(A测定管－A空白管)÷（A标准管- A空白管）]

C标准品：10 µmol/mL；V反总：反应总体积，0.8mL；V样：反应中加入样本体积，0.05mL；V样总：加入提取液体积，1mL；Cpr：上清液蛋白质浓度，mg/mL，需要另外测定，建议使用本公司BCA蛋白质含量测定试剂盒；W：样本质量，g；T：催化反应时间，10 min。