丙酮酸脱羧酶（PDC）测定试剂盒（微量法）

自备仪器和用品：                                                     

研钵、冰、台式离心机、紫外分光光度计/酶标仪、微量石英比色皿/96孔板、可调式移液枪和蒸馏水。

试剂组成和配制：                                                      

试剂一：液体100mL×1瓶，4℃保存。

试剂二：液体18mL×1瓶，4℃保存。

试剂三：液体2.5mL×1瓶，4℃保存。

试剂四：粉剂×1支，﹣20℃保存。

试剂五：液体30μL×1瓶，﹣20℃保存。

混合试剂：临用前配制，将试剂四和试剂五转移至试剂三中充分溶解待用，用不完的试剂分装后-20℃保存，禁止反复冻融。

试剂六：液体2mL×1管，4℃保存。

粗酶液提取：                                                          

1、细菌或细胞处理：收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；按照每200万细菌或细胞加入400μL提取液，超声波破碎细菌或细胞（功率200W，工作3s，间歇10s，工作35次），16000g 4℃离心20min，取上清，置冰上待测。

2、组织处理：按照组织质量（g）：试剂一体积(mL)为1：5~10的比例（建议称取约0.1g组织，加入1mL试剂一）进行冰浴匀浆，16000g 4℃离心20min，取上清，置冰上待测。

3、血清（浆）样品：直接检测。

PDC测定操作：                                                       

1. 分光光度计/酶标仪预热30min，调节波长到340 nm，蒸馏水调零。

2. 试剂二置于25℃水浴中预热30min。

3. 空白管：依次在微量石英比色皿/96孔板中加入20μL蒸馏水、20μL混合试剂、140μL试剂二和20μL试剂六，迅速混匀后于340nm比色，记录15s和75s的吸光值，分别记为A1和A2。

4. 测定管：依次在微量石英比色皿/96孔板中加入20μL上清液、20μL混合试剂、140μL试剂二和20μL试剂六，迅速混匀后于340nm比色，记录15s和75s的吸光值，分别记为A3和A4。

注意：空白管只需测定一次。

PDC活性计算：                                                        

a.使用微量石英比色皿测定的计算公式如下

（1）按照蛋白浓度计算

活性单位定义：25℃中，每毫克蛋白每分钟催化1nmol NADH 氧化为1个酶活单位。

PDC (nmol/min/mg prot) ={[(A3－A4)－(A1-A2)]÷ε÷d×V总×10⁹}÷(Cpr×V样) ÷T

=1608×[(A3－A4)－(A1-A2)]÷Cpr

（2）按照样本质量计算

活性单位定义：25℃中，每克组织每分钟催化1nmol NADH 氧化为1个酶活单位。

PDC (nmol/min /g 鲜重) ={[(A3－A4)－(A1-A2)]÷ε÷d×V总×10⁹}÷(W×V样÷V样总) ÷T

=1608×[(A3－A4)－(A1-A2)]÷W

（3）按细胞数量计算

活性单位定义：25℃中，每10⁴个细胞每分钟催化1nmol NADH 氧化为1个酶活单位。

PDC (nmol/min/10⁴cell) ={[(A3－A4)－(A1-A2)]÷ε÷d×V总×10⁹}÷(细胞数量×V样÷V样总) ÷T

=1608×[(A3－A4)－(A1-A2)]÷细胞数量

（4）按血清（浆）体积计算

活性单位定义：25℃中，每毫升血清（浆）每分钟催化1nmol NADH 氧化为1个酶活单位。PDC (nmol/min /mL) ={[(A3－A4)－(A1-A2)]÷ε÷d×V总×10⁹}÷V样÷T

=1608×[(A3－A4)－(A1-A2)]

ε：NADH摩尔消光系数，6.22×10³L/mol/cm；d：比色皿光径，1cm；V总：反应体系总体积，0.2mL=2×10^-4 L，V样：加入反应体系中上清液体积，0.02mL；V样总：提取液体积，1 mL；Cpr：蛋白浓度（mg/mL），需要另外测定，建议使用本公司BCA蛋白质含量试剂盒；W ：样品质量； T：反应时间，1 min。

b.使用96孔板测定的计算公式如下

（1）按照蛋白浓度计算

活性单位定义：25℃中，每毫克蛋白每分钟催化1nmol NADH 氧化为1个酶活单位。

PDC (nmol/min/mg prot) ={[(A3－A4)－(A1-A2)]÷ε÷d×V总×10⁹}÷(Cpr×V样) ÷T

=3215×[(A3－A4)－(A1-A2)]÷Cpr

（2）按照样本质量计算

活性单位定义：25℃中，每克组织每分钟催化1nmol NADH 氧化为1个酶活单位。

PDC (nmol/min /g 鲜重) ={[(A3－A4)－(A1-A2)]÷ε÷d×V总×10⁹}÷(W×V样÷V样总) ÷T

=3215×[(A3－A4)－(A1-A2)]÷W

（3）按细胞数量计算

活性单位定义：25℃中，每10⁴个细胞每分钟催化1nmol NADH 氧化为1个酶活单位。

PDC (nmol/min/10⁴cell) ={[(A3－A4)－(A1-A2)]÷ε÷d×V总×10⁹}÷(细胞数量×V样÷V样总) ÷T

=3215×[(A3－A4)－(A1-A2)]÷细胞数量

（4）按血清（浆）体积计算

活性单位定义：25℃中，每毫升血清（浆）每分钟催化1nmol NADH 氧化为1个酶活单位。PDC (nmol/min /mL) ={[(A3－A4)－(A1-A2)]÷ε÷d×V总×10⁹}÷V样÷T

=3215×[(A3－A4)－(A1-A2)]

ε：NADH摩尔消光系数，6.22×10³L/mol/cm；d：96孔板光径，0.5 cm；V总：反应体系总体积，0.2mL=2×10^-4 L，V样：加入反应体系中上清液体积，0.02mL；V样总：提取液体积，1 mL；Cpr：蛋白浓度（mg/mL），需要另外测定，建议使用本公司BCA蛋白质含量试剂盒；W ：样品质量； T：反应时间，1 min。