1.实验原理:
本试剂盒采用竞争法检测样本中肿瘤坏死因子α(TNF-α)的含量。向预先包被了抗体的酶标孔中加入样本,再加入生物素标记的识别抗原,在37℃下孵育30min,两者与固相抗体竞争结合形成免疫复合物,经PBST洗涤除去未结合的生物素抗原,然后加入亲和素-HRP,在37℃下孵育30min,亲和素-HRP与生物素抗原结合,洗涤后结合的HRP催化TMB(四甲基联苯胺)成蓝色,随后在酸的作用下转化成黄色,在450nm波长下有吸收峰,吸光值与样本中抗原的浓度成负相关
2.试剂盒组成:
试剂盒组成 | 48孔配置 | 96孔配置 | 保存 |
说明书 | 1份 | 1份 |
|
封板膜 | 2片(48) | 2片(96) |
|
密封袋 | 1个 | 1个 |
|
酶标包被板 | 1×48 | 1×96 | 长期-20℃ |
标准品(冻干粉) | 2支(定容至150μl) | 2支(定容至150μl) | 2-8℃ |
标准品/样品稀释液 | 3ml×1瓶 | 6ml×1瓶 | 2-8℃ |
生物素抗原(冻干粉) | 1支(稀释到3ml) | 1支(稀释到6ml) | 长期-20℃ |
亲和素-HRP(浓缩液) | 50μl(稀释到3ml) | 100μl (稀释到6ml) | 长期-20℃ |
生物素抗原稀释液 | 3ml×1瓶 | 6ml×1瓶 | 2-8℃ |
亲和素-HRP稀释液 | 2.95ml×1瓶 | 5.9ml×1瓶 | 2-8℃ |
显色剂A液 | 3ml×1瓶 | 6ml×1瓶 | 2-8℃ |
显色剂B液 | 3ml×1瓶 | 6ml×1瓶 | 2-8℃ |
终止液 | 3ml×1瓶 | 6ml×1瓶 | 2-8℃ |
浓缩洗涤液 | (20ml*25倍)×1瓶 | (20ml*25倍)×1瓶 | 2-8℃ |
备注:
1) 试剂盒中“标准品/样品稀释液”为超纯水(可用双蒸水替代),“终止液”为2M的H2SO4,洗涤液为含0.15%吐温-20的PBST,如不够可自行配制。
2) 不同公司的缓冲体系存在较大差异,请勿将本试剂盒的试剂与其他公司的试剂混用以免影响实验结果。
3) 浓缩洗涤液在低温下会有少量盐类析出,稍微加温后即会消失,不影响使用。
4) 浓缩生物素抗原和浓缩亲和素-HRP稀释前务必先离心同时应避免反复冻融
3.需要而未提供的试剂和器材
1) 37℃恒温箱。
2) 标准规格酶标仪。
3) 精密移液器及一次性吸头
4) 双蒸水或超纯水
5) 干净的试管或Eppendof管
6) 吸水纸
7) 自动洗板机或8道排枪
8) ELISA数据处理软件,推荐使用ELISACalc
9) 500ml烧杯的和适当量程的量筒
4.试剂准备
1) 使用前所有试剂应置于室温平衡至少30分钟。
2) 本试剂盒可以直接加样,如浓度过高,可以进行适当比例的稀释(推荐2-5倍稀释),计算时应将结果乘以稀释的倍数。
3) 洗涤液为25倍浓缩液,使用前将所有洗涤液倒入500ml或1L的烧杯中,用双蒸水定容到500ml即为工作液。
4) 标准品的稀释:先用标准品/样品稀释液将标准品冻干粉定容到150μl,然后漩涡混匀30秒即为标准品原液(24小时内用完)。取5支干净的Eppendorf管,每管加150μl的标准品稀释液,分别标记上400ng/L,200ng/L,100ng/L,50ng/L ,25ng/L .取150μl标准品原液加入标记400ng/L 的管中,混匀后同样取出150μl,加入下一管,以此类推直至***一管。零孔:直接加标准品/样品稀释液。(见下图)
原液 800ng/L 400ng/L 200ng/L 100ng/L 50ng/L 25ng/L
5)生物素抗原的稀释:抽取生物素抗原稀释液1ml到浓缩型生物素抗原中,漩涡混匀15秒至冻干粉完全溶解,然后将所有液体移入稀释液瓶中,再次漩涡混匀30秒即为生物素抗原工作液。
6) 亲和素-HRP的稀释:低速离心(使浓缩液全部沉到管底),将浓缩亲和素-HRP全部移入相应稀释液中然后漩涡混匀30秒即为亲和素-HRP工作液。
5.详细操作程序
1) 使用前请先将试剂盒在室温下平衡半小时。
2) 空白孔不加样,只加显色剂A,B和终止液用于调零。
3)标准品孔:每孔加入稀释好的标准品50μl,零孔加入标准品/样品稀释液50μl,然后加入生物素抗原工作液50μl(零孔必须要做,并将其作为标曲的最后一个点)。
4)样品孔:加入样品50μl(推荐直接加样,浓度高可以用样品稀释液稀释2-5倍),然后加入生物素抗原工作液50μl。
5) 轻轻摇晃,盖上封板膜,37℃培养箱中孵育30min。
6) 将25倍浓缩洗涤液用蒸馏水25倍稀释后备用。
7)第一次洗涤:小心揭掉封板膜,弃去液体,甩干,每孔加满洗涤液,静置30秒后弃去,如此重复5次,拍干。
8)加入50μl亲和素-HRP到标准品孔和样品孔中,轻轻摇晃,盖上封板膜,37℃培养箱中孵育30min。
9) 第二次洗涤:小心揭掉封板膜,弃去液体,甩干,每孔加满洗涤液,静置30秒后弃去,如此重复5次,拍干。
10) 显色:每孔先加入显色剂A 50μl,再加入显色剂B 50μl,轻轻震荡混匀,37℃避光显色10分钟。
11) 终止:每孔加终止液50μl,终止反应(此时蓝色立转黄色).
12) 测定:以空白孔调零,450nm波长依序测量各孔的吸光度(OD值)。 测定应在加终止液后10分钟以内进行。
13) 计算:根据浓度和OD值算出标准曲线的回归方程,建议用专用计算软件进行计算,推荐使用ELISAcalc进行计算,拟合模型选用logistic曲线(四参数)。
局限性
1)实验人员,操作习惯、 洗涤技术、孵育温度、显色时间及试剂盒保存时间等因素的改变都会影响实验的效果。
2)本试剂盒已经尽力去除或降低了生物学样本中内源性干扰因素,但非所有可能的影响因素全部排出。
3)样本浓度仅在盒子设 计的检测范围内可以检测,超出范围无法检测。
4)样本反复冻融或榕血会影响实验结果。
必要说明
1)本试剂盒用于科学研究,不能用于诊断治疗。
2)试剂盒中化学试剂具有潜在危害,操作时请佩戴白大衣、我胶手套、安全眼镜等防护设施。
3)试剂盒中的终止液为酸性溶液,在使用终止液时,请佩戴防护服,及防护眼睛、手及西部的设施。以避兔试剂接触皮肤和眼睛。如不慎接触,请立即用大量清水清洗,及时就医。
4)请不要使用其他批号或其他来源的试剂替代本试剂盒中的试剂。
5)请不要使用过期的试剂。
6)在试剂盒的贮存或孵育过程请避免强光照射。
7)在操作试剂盒或处理样本的区域请不要饮食。
8)不要让试剂或样本接触皮肤和粘膜,操作试剂盒或处理样本时请佩戴乳胶或一次性手套。
9)显色底物避免与氧化试剂和金属接触,显色底物在使用之前必须平衡至室温。
10)为了避免微生物的精染,以及试剂与样本间的交叉宿染,请使用一次性枪头。
11)使用干净的容器配制试剂,试剂的准备必须使用蒸饱水或去离子水。
12)暴露于酸性环境会抑制结合。
13)不同公司的缓冲体系存在较大差异,请勿将本试剂盒的试剂与其他公司的试剂混用。
14)浓缩恍涤液在低温下会有少量盐类析出,稍微加温后即会消失,不影响使用。
15)浓缩生物素抗原和浓缩亲和素-HRP:稀释前务必先离心同时应避免反复冻融。
16)样本可能含有传染性病原体,处理样本和可能的污染材料的***方法121.5C,60min。实验剩余试剂、样本的处理请遵循生化实验室废弃物处理的相关规定进行。
样本处理
1) 标本采集后尽早进行提取,提取按相关文献进行,提取后应尽快进行实验。若不能马上进行试验,可将标本放于-20℃保存,但应避免反复冻融。
2) 血清:室温血液自然凝固10-20分钟,离心20分钟左右(2000-3000转/分)。仔细收集上清,检测前如有沉淀,应再次离心。
3) 血浆:应根据检测指标的要求选择EDTA或枸橼酸钠或肝素作为抗凝剂,混合10-20分钟后,离心20分钟左右(2000-3000转/分)。仔细收集上请,检测前如有沉淀,应再次离心。
4) 尿液:用无菌管收集,离心20分钟左右(2000-3000转/分)。仔细收集上清,保存过程中如有沉淀形成,应再次离心。胸腹水、脑脊液参照实行。
5)
细胞培养上清:检测分泌性的成份时,用无菌管收集。离心20分钟左右(2000-3000转/分)。仔细收集上清。检测细胞内的成份时,用PBS(PH7.2-7.4)稀释细胞悬液,细胞浓度达到100万/ml左右。通过反复冻融,以使细胞破坏并放出细胞内成份。离心20分钟左右(2000-3000转/分)。仔细收集上清。保存过程中如有沉淀形成,应再次离心。
6)
组织标本:切割标本后,称取重量(1g),加入一定量(9ml)的PBS(PH7.4)。用手工或匀浆器将标本匀浆充分。离心20分钟左右(2000-3000转/分)。仔细收集上清。分装后一份待检测,其余冷冻备用。样本不足1g,按照1:9加入PBS后匀浆即可。
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