多功能氧化酶（MFO）测定试剂盒（微量法）

自备用品：                                                             

酶标仪、台式离心机、可调式移液器、96孔板、研钵、冰、蒸馏水、氯仿。

试剂组成和配制：                                                            

提取液：液体120mL×1瓶，4℃保存;

试剂一：液体24mL×1瓶，4℃避光保存;

试剂二：粉剂×3管，-20℃保存；临用前取一管加入1.5mL水溶解，现配现用。

试剂三：液体24mL×1瓶，4℃保存;

试剂四：液体64mL×1瓶，4℃保存。

粗酶液提取：                                                             

按照组织质量（g）：提取液（mL)为1：5~10的比例（建议称取约0.1g组织，加入1mL提取液），进行冰浴匀浆。12000g 4℃离心20min，取上清，置冰上待测。

测定步骤：                                                            

1、  酶标仪预热30min以上，调节波长至400nm。

2、在EP管中依次加入如下试剂

分别加入1000μL氯仿，充分混匀萃取，静置10min，取下层氯仿层0.6mL至新的EP管中。再加入试剂四0.6mL，充分混匀萃取，取上层水相0.2mL于96孔板中，400nm下测定吸光值A测定与A空白，△A=A测定-A空白。空白管只需测一管。

MFO活性计算:                                                             

标准曲线：y = 0.0119x + 0.0021，R² = 0.9997；y，吸光度；x,标准品浓度，单位nmol/mL。

（1）按样本质量计算

单位定义：每g样本每分钟产生1nmol对硝基苯酚定义为一个酶活力单位。

MFO（nmol/min/g 鲜重）=（△A-0.0021）÷0.0119×V总÷(V样÷V样总×W)÷T

                        =8.4×（△A-0.0021）÷W

（2）按样本蛋白浓度计算

单位定义：每mg组织蛋白每分钟产生1nmol对硝基苯酚定义为一个酶活力单位。

MFO（nmol/min/mg prot）=（△A-0.0021）÷0.0119×V总÷(V样×Cpr)÷T

                        =8.4×（△A-0.0021）÷Cpr

V总：最终萃取液体积，0.6 mL；V样：反应中样品体积，200μL；T：反应时间，30min；W：样品质量，g；Cpr：样本蛋白浓度，mg/mL。