酪氨酸解氨酶（TAL）测定试剂盒（微量法）

需自备的仪器和用品：                                                     

酶标仪、台式离心机、可调式移液器、96孔板（UV板）、研钵、冰和蒸馏水

试剂组成和配制：                                                         

提取液：液体100mL×1瓶，4℃保存；

试剂一：液体50mL×1瓶，4℃保存；

试剂二：粉剂×2瓶，4℃保存；

试剂三：液体5mL×1瓶，4℃保存；

粗酶液提取：                                                              

1、细菌、细胞或组织样品的制备：

细菌或培养细胞：先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；按照细菌或细胞数量（10⁴个）：提取液体积（mL）为500~1000：1的比例（建议500万细菌或细胞加入1mL提取液），超声波破碎细菌或细胞（冰浴，功率20％或200W，超声3s，间隔10s，重复30次）；8000g 4℃离心10min，取上清，置冰上待测。

组织：按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为1：5~10的比例（建议称取约0.1g组织，加入1mL提取液），进行冰浴匀浆。8000g 4℃离心10min，取上清，置冰上待测。

2、血清（浆）果汁等液体样品：直接检测。

测定步骤：                                                              

1、 酶标仪预热30min以上，调节波长至333nm。

2、  准备96孔UV板一块（非普通酶标板，普通酶标板只能透过可见光，不能透过紫外光，检测波长小于340nm务必使用UV板）。

3、  试剂二的配置：临用前在试剂二瓶中加入10mL试剂一充分溶解待用（用不完的试剂4℃保存一周，注意现配现用），在37℃（哺乳动物）或25℃（其它物种）水浴10min以上。

4、在EP管中依次加入如下试剂

混匀，10000g 4℃离心5min，取200μL上清至96孔UV板，333nm下测定吸光值A测定与A对照，ΔA=A测定-A对照

TAL活性计算：                                                              

1、血清（浆）或果汁TAL活性

单位的定义：每分钟每mL血清（浆）或果汁在每mL反应体系中使333nm处吸光值变化

0.005为一个酶活力单位。

TAL（U/mL）=ΔA×V反总÷( V样÷V样总)÷0.005÷T =35×ΔA

2、组织、细菌或细胞TAL活性

（1）按样本蛋白浓度计算：

单位定义：每分钟每mg组织蛋白在每mL反应体系中使333nm处吸光值变化0.005为一个

酶活力单位。

TAL（U/mg prot）=ΔA×V反总÷（V样×Cpr）÷0.005÷T =35×ΔA÷Cpr

此法需要自行测定样本蛋白质浓度。

（2）按样本鲜重计算：

单位定义：每分钟每g组织在每mL反应体系中使333nm处吸光值变化0.005为一个

酶活力单位。

TAL（U/g 鲜重）=ΔA×V反总÷(W× V样÷V样总)÷0.005÷T =35×ΔA÷W

（3）按细菌或细胞密度计算：

单位定义：每分钟每1万个细菌或细胞在每mL反应体系中使333nm处吸光值变化0.005为一个酶活力单位。

TAL（U/10⁴ cell）=ΔA×V反总÷(500×V样÷V样总)÷0.005÷T =0.07×ΔA

V反总：反应体系总体积，0.42mL；V样：加入样本体积，0.04mL；V样总：加入提取液体积，1 mL；T：反应时间，60 min；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，g；500：细胞或细菌总数，500万。