单宁酶（TAN）检测试剂盒（微量法）

需自备的的仪器和用品                                                   

紫外分光光度计/酶标仪、水浴锅、台式离心机、可调式移液器、微量石英比色皿/96孔UV板、研钵、冰、蒸馏水

试剂的组成和配制                                                         

试剂一：液体100mL×2瓶，4℃保存；

试剂二：粉剂×1支，4℃保存；临用前每支加入6mL试剂一，充分溶解后备用；用不完的试剂4℃保存；

粗酶液提取                                                              

按照组织质量（g）：试剂一体积(mL)为1：5~10的比例（建议称取约0.1g组织，加入1mL试剂一），进行冰浴匀浆。10000g 4℃离心10min，取上清，置冰上待测。

液体样本：直接取上清测定。

测定步骤                                                            

1、分光光度计预热30min以上，调节波长到270 nm，蒸馏水调零。

2、加样表

混匀，40℃准确保温10 min后，置95℃水浴中10 min（盖紧，防止水分散失），冷却

混匀，取200uL至微量石英比色皿或96孔UV板中，270nm处读取各管吸光值。计算ΔA=A对照-A测定。每个测定管需设个一个对照管。

注意：

1、  可以在不同对照管中加入不同样品的粗酶液，然后集中进行5min 95℃沸水浴处理。

2、  务必使用96孔UV板（非普通酶标板，普通酶标板只能透过可见光，不能透过紫外光，检测波长小于340nm务必使用UV板）。

TAN活力单位的计算                                                   

a.用微量石英比色皿测定的计算公式如下

标准条件下测定回归方程为y = 0.0058x + 0.0044，R2 = 0.9994；x为PG含量（µmol/L），y为吸光值。

1、按样本体积计算

单位的定义：40℃下每毫升粗酶液每分钟水解减少0.01µmol底物PG所需要的酶量定义为一个酶活单位。

TAN活性(µmol/min/mL)=(ΔA-0.0044）÷0.0058÷1000×V反总÷0.01÷V样÷T

=34.48×( ΔA-0.0044）

2、按照蛋白浓度计算

单位的定义：40℃下每毫克蛋白每分钟水解减少0.01µmol底物PG所需要的酶量定义为一个酶活单位(U)。

TAN活性((µmol/min/mg prot)=(ΔA-0.0044）÷0.0058÷1000×V反总÷0.01÷(V样×Cpr)÷T

=34.48×(ΔA-0.0044）÷Cpr

3、按照样本鲜重计算

单位的定义：40℃下每克样品每分钟水解减少0.01µmol底物PG所需要的酶量定义为一个酶活单位(U)。

TAN活性(µmol/min/g 鲜重)=(ΔA-0.0044）÷0.0058÷1000×V反总÷0.01÷(V样÷V样总×W)÷T

=34.48×(ΔA-0.0044）÷W

V反总：反应体系总体积，1mL； V样：加入样本体积，0.05mL；V样总：加入提取液体积，1 mL；T：反应时间，10min；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，g。

b.用96孔板测定的计算公式如下

标准条件下测定回归方程为y = 0.0029x + 0.0044，R2 = 0.9994；x为PG含量（µmol/L），y为吸光值。

1、按样本体积计算

单位的定义：40℃下每毫升粗酶液每分钟水解减少0.01µmol底物PG所需要的酶量定义为一个酶活单位(U)。

TAN活性(µmol/min/mL)=(ΔA-0.0044）÷0.0029÷1000×V反总÷0.01÷V样÷T

=68.97×( ΔA-0.0044）

2、按照蛋白浓度计算

单位的定义：40℃下每毫克蛋白每分钟水解减少1µmol底物PG所需要的酶量定义为一个酶活单位(U)。

TAN活性(µmol/min/mg prot)=(ΔA-0.0044）÷0.0029÷1000×V反总÷0.01÷(V样×Cpr)÷T

=68.97×( ΔA-0.0044）÷Cpr

3、按照样本鲜重计算

单位的定义：40℃下每克样品每分钟水解减少0.01µmol底物PG所需要的酶量定义为一个酶活单位(U)。

TAN活性(µmol/min/g 鲜重)=(ΔA-0.0044）÷0.0029÷1000×V反总÷0.01÷(V样÷V样总×W)÷T

=68.97×( ΔA-0.0044）÷W

V反总：反应体系总体积，1mL； V样：加入样本体积，0.05mL；V样总：加入提取液体积，1 mL；T：反应时间，10min；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，g。