胰蛋白酶（Trypsin）测定试剂盒（微量法）

自备仪器和用品：                                                      

酶标仪、96孔板、台式离心机、水浴锅、可调式移液器、研钵、冰和蒸馏水。

试剂组成和配制：                                                     

提取液：液体120 mL×1瓶，4℃保存。

试剂一：液体5 mL×1瓶，4℃保存。

试剂二：液体5 mL×1瓶，4℃避光保存。

试剂三：液体2 mL×1瓶，4℃保存。

粗酶液提取：                                                            

1. 组织样品：按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为1：5~10的比例（建议称取约0.1g组织，加入1mL提取液）冰浴匀浆，10000g，4℃离心10min，取上清，即粗酶液。

测定步骤：                                                           

1. 酶标仪预热30 min，调节波长到555 nm。

2. 工作液的配制：临用前根据用量按照试剂一（V）：试剂二（V）：蒸馏水（V）：试剂三（V）=1 mL：1 mL：5.4 mL：0.4 mL的比例充分混合。（注意：现用现配，用多少配多少，在空瓶中配制，试剂盒中带有4个空瓶）

3. 吸取5μL样本，加入195 μL工作液，混匀后立即测定，记录555nm下1min时的吸光值A1和2min时的吸光值A2。计算△A=A1-A2

注意：如果△A小于0.005，可将反应时间延长到5min。如果△A大于0.5，体系迅速变色，可将样本用提取液稀释后测定（建议稀释10倍），计算公式中乘以相应稀释倍数。

胰蛋白酶活性计算公式：                                                

使用96孔板测定的计算公式如下

（1）按蛋白浓度计算

活性单位定义：室温下每毫克蛋白质每分钟催化555nm处吸光值减少0.5为1个酶活单位。

胰蛋白酶（U/mg prot）= △A ×V反总 ÷（Cpr×V1）÷0.5÷T

=80×△A ÷Cpr

（2）按样本质量计算

活性单位定义：室温每克组织每分钟催化555nm处吸光值减少0.5为1个酶活单位。

胰蛋白酶（U/g 鲜重）= △A×V反总÷（W×V1÷V2）÷0.5÷T

=80×△A ÷W

Cpr：粗酶液蛋白质浓度（mg/mL），需要另外测定；W：组织质量（g）；V1：加入反应体系中粗酶液体积（mL），5 μL=0.005 mL；V2：粗酶液总体积（mL），1 mL；V反总：反应总体积，0.2 mL；T：反应时间（min），1 min。