中性蛋白酶（Neutral protease, NP）测定试剂盒（微量法 ）

自备仪器和用品：                                                     

可见分光光度计/酶标仪、微量玻璃比色皿/96孔板、水浴锅、磁力搅拌器、可调式移液枪、1.5 mL EP管和蒸馏水。

试剂组成和配制：                                                      

试剂一：液体100mL×1瓶，4℃保存。

试剂二：粉剂×1瓶，4℃保存。临用前加4mL蒸馏水溶解。

试剂三：粉剂×1瓶，4℃避光保存。临用前加入10mL试剂一，沸水浴中磁力搅拌溶解。（可在烧杯上盖一层保鲜膜，注意观察，避免水分全部蒸发，一般加热15-30分钟，该试剂为过饱和试剂，充分混匀后仍出现颗粒物不溶物不影响使用）。

试剂四：粉剂×1瓶， 4℃保存。临用前加20mL蒸馏水溶解。

试剂五：液体4mL×1瓶，4℃保存。

标准品：液体1mL×1支，0.25μmol/mL标准酪氨酸溶液，4℃保存。

粗酶液提取：                                                         

1.       组织：按照组织质量（g）：试剂一体积(mL)为1：5~10的比例（建议称取约0.1g组织，加入1mL试剂一）冰浴匀浆，8000g，4℃离心10min，取上清，即粗酶液。

2.       血清或培养液：直接测定。

3.       细菌、真菌：按照细胞数量（10⁴个）：试剂一体积（mL）为500~1000：1的比例（建议500万细胞加入1mL试剂一），冰浴超声波破碎细胞（功率300w，超声3秒，间隔7秒，总时间3min）；然后8000g，4℃，离心10min，取上清置于冰上待测。

测定操作：                                                           

1. 分光光度计/酶标仪预热30min，调节波长到680 nm，蒸馏水调零。

2. 试剂二、试剂三和试剂四置于30℃水浴保温30min。

3. 对照管：取0.5 mL EP管，加入20μL粗酶液，40μL试剂二，混匀后置于30℃水浴保温10min；加入40μL试剂三，混匀后8000g，4℃离心10min；取40μL上清液，加入新的EP管，再加入200μL试剂四，40μL试剂五，混匀后置于30℃水浴保温20min，取200μL于微量玻璃比色皿/96孔板，于680nm测定光吸收，记为A对照管。

4. 测定管：取0.5 mL EP管，加入20μL粗酶液，40μL试剂三，混匀后置于30℃水浴保温10min；加入40μL试剂二，混匀后8000g， 4℃离心10min；取40μL上清液，加入新的EP管，再加入200μL试剂四，40μL试剂五，混匀后置于30℃水浴保温20min，取200μL于微量玻璃比色皿/96孔板，于680nm测定光吸收，记为A测定管。（注意与空白管不同，先加试剂三，后加试剂二）

5. 空白管：取0.5 mL EP管，加入40μL蒸馏水，200μL试剂四，40μL试剂五，混匀后置于30℃水浴保温20min，取200μL于微量玻璃比色皿/96孔板，于680nm测定光吸收，记为A空白管。

6. 标准管：取0.5 mL EP管，加入40μL标准品，200μL试剂四，40μL试剂五，混匀后置于30℃水浴保温20min，取200μL于微量玻璃比色皿/96孔板，于680nm测定光吸收，记为A标准管。

注意：空白管和标准管只需要测定一次。

计算公式：                                                                

1. 按照样本蛋白浓度计算

NP活性单位定义：30℃每毫克蛋白每分钟水解产生1nmol酪氨酸为1个酶活单位。

NP活性（nmol/min /mg prot）= C标准品×（A测定管－A对照管）÷（A标准管－A空白管）×V反总÷(Cpr×V1)÷T= 125×（A测定管－A对照管）÷（A标准管－A空白管）÷Cpr

2．按照样本质量计算

NP活性单位定义：30℃每克样品每分钟催化水解产生1 nmol酪氨酸为1个酶活单位。

NP活性（nmol/min /g鲜重）=C标准品×（A测定管－A对照管）÷（A标准管－A空白管）×V反总÷（W×V1÷V2）÷T= 125×（A测定管－A对照管）÷（A标准管－A空白管）÷W

3. 按照液体体积计算

NP活性单位定义：30℃每毫升样品每分钟催化水解产生1nmol酪氨酸为1个酶活单位。

NP活性（nmol/min/mL）=C标准品×（A测定管－A对照管）÷（A标准管－A空白管）×V反总÷V1÷T= 125×（A测定管－A对照管）÷（A标准管－A空白管）

4.       按照细胞数量计算

NP活性单位定义：30℃每10⁴个细胞每分钟催化水解产生1nmol酪氨酸为1个酶活单位。

NP活性（nmol/min /10⁴ cell）=C标准品×（A测定管－A对照管）÷（A标准管－A空白管）×V反总÷（细胞数量×V1÷V2）÷T= 125×（A测定管－A对照管）÷（A标准管－A空白管）÷细胞数量

C标准品：0.25 μ mol/mL标准酪氨酸溶液；V反总：酶促反应总体积，0.1mL；Cpr：粗酶液蛋白质浓度（mg/mL）；V1：加入反应体系中粗酶液体积（mL），0.02 mL；V2：提取液总体积（mL），1mL；T：催化反应时间（min），10min；W：样品质量（g）。

注意事项：                                                           

临用前配制的试剂配制好后4℃保存，并且3天内使用完毕。