鸟氨酸转氨酶(δ-OAT)测定试剂盒

自备实验用品及仪器                                                    

天平、低温离心机、研钵、酶标仪、96孔板。

试剂组成和配制                                                        

提取液：液体110mL×1瓶，4℃保存。

试剂一：液体30 mL×1瓶，4℃保存。

试剂二：粉剂×1瓶，4℃保存；临用前加8mL试剂一充分溶解；用不完的试剂4℃保存。

试剂三：粉剂×1瓶，4℃保存；临用前加8mL试剂一充分溶解；用不完的试剂4℃保存。

试剂四：粉剂×2瓶，-20℃保存；临用前每瓶加4mL试剂一充分溶解；现配现用。

酶液提取                                                               

组织：按照质量（g）：提取液体积(mL)为1：5~10的比例（建议称取约0.1g，加入1mL提取液）加入提取液，冰浴匀浆后于4℃，10000g离心10min，取上清置冰上待测。

细胞：按照细胞数量（10⁴个）：提取液体积（mL）为500~1000：1的比例（建议500万细胞加入1mL提取液），冰浴超声波破碎细胞（功率300w，超声3秒，间隔7秒，总时间3min）；然后4℃，10000g离心10min，取上清置冰上待测。

液体：直接检测。

测定操作                                                             

酶标仪预热30min，调节波长至340nm。

将配好的试剂二、三、四37℃预热5min。（注意：粉剂试剂需要自行配制）

取96孔板，依次加入60μL试剂二，60μL试剂三，60μL试剂四，20μL粗酶液，充分混匀，记录340nm处初始吸光值和37℃反应10min的吸光值A2，△A=A1-A2。

计算公式                                                             

用96孔板测定的计算公式如下

（1）按照样本蛋白浓度计算

酶活单位定义：每毫克组织蛋白每分钟消耗1 nmol的NADH定义为一个酶活力单位。

δ-OAT（nmol/min /mg prot）=ΔA÷（ε×d）×V反总÷(V样×Cpr) ÷T

=321.54×ΔA÷Cpr

（2）按照样本质量计算

酶活单位定义：每克组织每分钟消耗1 nmol的NADH定义为一个酶活力单位。

δ-OAT（nmol/min /g 鲜重）=ΔA÷（ε×d）×V反总÷(W ×V样÷V样总) ÷T

=321.54×ΔA÷W

（3）按照细胞数量计算

酶活单位定义：每10⁴个细胞每分钟消耗1 nmol的NADH定义为一个酶活力单位。

δ-OAT（nmol/min /10⁴ cell）= ΔA÷（ε×d）×V反总÷(V样×细胞数量÷V样总) ÷T

=321.54×ΔA÷细胞数量

（4）按照液体体积计算

酶活单位定义：每毫升液体每分钟消耗1 nmol的NADH定义为一个酶活力单位。

δ-OAT（nmol/min /mL）＝ΔA÷（ε×d）×V反总÷V样÷T

=321.54×ΔA

V反总：反应体系总体积，0.2mL；ε：NADH摩尔消光系数，6.22×10³ L / mol /cm；d：96孔板光径，0.5cm；V样：加入样本体积，0.02mL；V样总：加入提取液体积，1mL；T：反应时间，10 min；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，g