原理:本试剂盒采用的是生物素双抗体夹心酶联免疫吸附法(ELISA)测定样品中植物脱落酸(ABA)的水平。向预先包被了植物脱落酸(ABA)单克隆抗体的酶标孔中加入脱落酸(ABA),加入生物素标记的抗ABA抗体,再与链霉亲和素-HRP结合,形成免疫复合物,再经过温育和洗涤,去除未结合的酶,然后加入底物A、B,产生蓝色,并在酸的作用下转化成***终的黄色。颜色的深浅与样品中植物脱落酸(ABA)的浓度呈正相关。
试剂盒组成:
1 | 标准品160ng/ml | 0.5ml | 7 | 显色剂A液 | 6ml |
2 | 标准品稀释液 | 3ml | 8 | 显色剂B液 | 6ml |
3 | 酶标包被板 | 12孔×8条 | 9 | 终止液 | 6ml |
4 | 链霉亲和素-HRP | 6ml | 10 | 说明书 | 1份 |
5 | 30倍浓缩洗涤液 | 20ml | 11 | 封板膜 | 2张 |
6 | 生物素标记的抗-ABA抗体 | 1ml | 12 | 密封袋 | 1个 |
需要而未提供的试剂和器材:
1. 37℃恒温箱。
2. 标准规格酶标仪。
3. 精密移液器及一次性吸头
4. 蒸馏水
5. 一次性试管
6. 吸水纸等
标本要求:
1.不能检测含NaN3的样品,因NaN3抑制辣根过氧化物酶的(HRP)活性。
2.标本采集后尽早进行提取,提取按相关文献进行,提取后应尽快进行实验。若不能马上进行试验,可将标本放于-20℃保存,但应避免反复冻融
注意事项:
1. 从2-8℃取出的试剂盒,在开启试剂盒之前要室温平衡至少30分钟。酶标包被板开封后如未用完,板条应装入密封袋中保存。
2. 各步加样均应使用加样器,并经常校对其准确性,以避免试验误差。
3. 严格按照说明书的操作进行,试验结果判定必须以酶标仪读数为准。
4. 为避免交叉污染,要避免重复使用手中的吸头和封板膜。
5. 不用的其它试剂应包装好或盖好。不同批号的试剂不要混用。保质前使用。
6. 底物B对光敏感,避免长时间暴露于光下。
洗板方法:
手工洗板方法:甩掉酶标板内的液体;在实验台上铺垫几层吸水纸,酶标板朝下用力拍几次;将稀释后的洗涤液至少0.35ml注入孔内,浸泡1-2分钟。根据需要,重复此过程数次。
自动洗板:如果有自动洗板机,应在熟练使用后再用到正式实验过程中。
操作程序:
1. 标准品的稀释:(本试剂盒提供原倍标准品一支,用户请按照说明自行在小试管中倍比稀释):
80ng/ml | (5号标准品) | 120μl的原倍标准品加入120μl的标准品稀释液 |
40ng/ml | (4号标准品) | 120μl的5号标准品加入120μl的标准品稀释液 |
20ng/ml | (3号标准品) | 120μl的4号标准品加入120μl的标准品稀释液 |
10ng/ml | (2号标准品) | 120μl的3号标准品加入120μl的标准品稀释液 |
5ng/ml | (1号标准品) | 120μl的2号标准品加入120μl的标准品稀释液 |
2. 根据待测样品数量加上标准品的数量决定所需的板条数。每个标准品和空白孔建议做复孔。每个样品根据自己的数量来定,能使用复孔的尽量做复孔。
3. 加样:1)空白孔:空白对照孔不加样品,生物素标记的抗ABA抗体,链霉亲和素-HRP,只加显色剂A&B和终止液,其余各步操作相同;2)标准品孔:加入标准品50μl,链霉素-HRP50μl(标准品中已事先整合好生物素抗体,故不加);3)待测样品孔:加入样本40μl,然后各加入抗- ABA抗体10μl、链酶亲和素-HRP50μl,盖上封板膜,轻轻振荡混匀,37℃温育60分钟。
4. 配液:将30倍浓缩洗涤液用蒸馏水30倍稀释后备用。
5. 洗涤:小心揭掉封板膜,弃去液体,甩干,每孔加满洗涤液,静置30秒后弃去,如此重复5次,拍干。
6. 显色:每孔先加入显色剂A 50μl,再加入显色剂B 50μl,轻轻震荡混匀,37℃避光显色10分钟。
7. 终止:每孔加终止液50μl,终止反应(此时蓝色立转黄色)。
8. 测定:以空白空调零,450nm波长依序测量各孔的吸光度(OD值)。 测定应在加终止液后10分钟以内进行。
9.根据标准品的浓度及对应的OD值计算出标准曲线的直线回归方程,再根据样品的OD值在回归方程上计算出对应的样品浓度。也可以使用各种应用软件来计算。
1) 本试剂盒用于科学研究,不能用于诊断治疗。
2) 试剂盒中化学试剂具有潜在危害,操作时请佩戴白大衣、乳胶手套、安全眼镜等防护设施。
3) 试剂盒中的终止液为酸性溶液,在使用终止液时,请佩戴防护服,及防护眼睛、手及西部的设施。以避兔试剂接触皮肤和眼睛。如不慎接触,请立即用大量清水清洗,及时就医。
4) 请不要使用其他批号或其他来源的试剂替代本试剂盒中的试剂。
5) 请不要使用过期的试剂。
6) 在试剂盒的贮存或孵育过程请避免强光照射。
7) 在操作试剂盒或处理样本的区域请不要饮食。
8) 不要让试剂或样本接触皮肤和粘膜,操作试剂盒或处理样本时请佩戴乳胶或一次性手套。
9) 显色底物避免与氧化试剂和金属接触,显色底物在使用之前必须平衡至室温。
10) 为了避免微生物的精染,以及试剂与样本间的交叉宿染,请使用一次性枪头。
11) 使用干净的容器配制试剂,试剂的准备必须使用蒸饱水或去离子水。
12) 暴露于酸性环境会抑制结合。
13) 不同公司的缓冲体系存在较大差异,请勿将本试剂盒的试剂与其他公司的试剂混用。
14) 浓缩恍涤液在低温下会有少量盐类析出,稍微加温后即会消失,不影响使用。
15) 浓缩生物素抗原和浓缩亲和素-HRP:稀释前务必先离心同时应避免反复冻融。
16) 样本可能含有传染性病原体,处理样本和可能的污染材料的***方法121.5C,60min。
17) 实验剩余试剂、样本的处理请遵循生化实验室废弃物处理的相关规定进行。