本试剂盒采用竞争法(间接法)检测样本中C反应蛋白(CRP)的含量。向预先包被了相关抗体的酶标孔中加入样本,再加入辣根过氧化物酶标记的识别抗原,在37℃下孵育1小时,两者与固相抗体竞争结合形成免疫复合物,经PBST洗涤后,结合的HRP催化TMB(四甲基联苯胺)成蓝色,随后在酸的作用下转化成黄色,在450nm波长下有吸收峰,吸光值与样本中抗原的浓度成负相关。
2.试剂盒组成:
试剂盒组成 | 48孔配置 | 96孔配置 | 保存 |
说明书 | 1份 | 1份 |
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封板膜 | 2片(48) | 2片(96) |
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密封袋 | 1个 | 1个 |
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酶标包被板 | 1×48 | 1×96 | 2-8℃保存 |
标准品:240ug/ml | 0.5ml×1瓶 | 0.5ml×1瓶 | 2-8℃保存 |
标准品/样品稀释液 | 3ml×1瓶 | 6ml×1瓶 | 2-8℃保存 |
酶标试剂 | 3ml×1瓶 | 6ml×1瓶 | 2-8℃保存 |
显色剂A液 | 3ml×1瓶 | 6ml×1瓶 | 2-8℃保存 |
显色剂B液 | 3ml×1瓶 | 6ml×1瓶 | 2-8℃保存 |
终止液 | 3ml×1瓶 | 6ml×1瓶 | 2-8℃保存 |
浓缩洗涤液 | (20ml×25倍)×1瓶 | (20ml×25倍)×1瓶 | 2-8℃保存 |
备注:
a.试剂盒中“样品稀释液”为0.05M的PBS,“终止液”为2M的H2SO4,洗涤液为含0.15%吐温-20的PBST,如不够可自行配制。
b.不同公司的缓冲体系存在较大差异,请勿将本试剂盒的试剂与其他公司的试剂混用以免影响实验结果。
c.浓缩洗涤液在低温下会有少量盐类析出,稍微加温后即会消失,不影响使用。
3.试剂盒保存
本试剂盒可以在2-8℃下保存6个月,在-20℃下可以保存更长的时间。酶标板为真空包装,板条可以拆卸,拆开以后如一次不能用完,请放入提供的密封袋中,放入干燥剂,2-8℃保存,在一个月之内仍然有效。试剂不能反复冻融。
4.需要而未提供的试剂和器材
1. 37℃恒温箱。
2. 标准规格酶标仪。
3. 精密移液器及一次性吸头
4. 双蒸水或超纯水
5. 干净的试管或Eppendof管
6. 吸水纸
7. 自动洗板机或8道排枪
8. ELISA数据处理软件,推荐使用ELISACalc
9. 500ml烧杯的和适当量程的量筒
5.试剂准备
a. 使用前所有试剂应置于室温平衡至少30分钟。
b. 本试剂盒可以直接加样,如浓度过高,可以进行适当比例的稀释(推荐2-5倍稀释),计算时应将结果乘以稀释的倍数。
c. 洗涤液为25倍浓缩液,使用前将所有洗涤液倒入500ml或1L的烧杯中,用双蒸水定容到500ml即为工作液。
d. 标准品的稀释:取5支干净的Eppendorf管,每管加150μl的标准品稀释液,分别标记上标准品1,标准品2,标准品3,标准品4,标准品5.取150μl标准品原液加入标记标准品1 的管中,混匀后同样取出150μl,加入下一管,以此类推直至***一管。零孔:直接加标准品/样品稀释液。(见下图)
原液 标准品1 标准品2 标准品3 标准品4 标准品5
6.洗板方法
a. 手工洗板:先洗去酶标孔中的的液体,在吸水纸上拍干,然后每孔加入300μl稀释好的洗涤液,轻轻摇晃30秒,然后甩掉,在吸水纸上拍干,重复4-5次。
b. 洗板机洗板:洗板机洗板比较便捷,但应操作熟练后使用。
7.详细操作程序
a. 使用前请先将试剂盒在室温下平衡半小时。
b. 空白孔不加样,只加显色剂A,B和终止液用于调零。
c. 标准品孔:每孔加入稀释好的标准品50μl,零孔加入标准品/样品稀释液50μl,然后加入酶标试剂50μl。
d. 样品孔:加入样品50μl(推荐直接加样,浓度高可以用样品稀释液稀释2-5倍),然后加入酶标试剂50μl。
e. 轻轻摇晃,盖上封板膜,37℃培养箱中孵育60min。
f. 将25倍浓缩洗涤液用蒸馏水25倍稀释后备用。
g. 洗涤:小心揭掉封板膜,弃去液体,甩干,每孔加满洗涤液,静置30秒后弃去,如此重复5次,拍干。
h. 显色:每孔先加入显色剂A 50μl,再加入显色剂B 50μl,轻轻震荡混匀,37℃避光显色10分钟。
i. 终止:每孔加终止液50μl,终止反应(此时蓝色立转黄色)。
j. 测定:以空白孔调零,450nm波长依序测量各孔的吸光度(OD值)。 测定应在加终止液后10分钟以内进行。
k. 计算:根据浓度和OD值算出标准曲线的回归方程,建议用专用计算软件进行计算,推荐使用ELISAcalc进行计算,拟合模型选用logistic曲线(四参数)。
样本前处理
a.标本采集后尽早进行提取,提取按相关文献进行,提取后应尽快进行实验。若不能马上进行试验,可将标本放于-20℃保存,但应避免反复冻融。
b.血清:室温血液自然凝固10-20分钟,离心20分钟左右(2000-3000转/分)。仔细收集上清,保存过程中如出现沉淀,应再次离心。
c.血浆:应根据标本的要求选择EDTA或柠檬酸钠作为抗凝剂,混合10-20分钟后,离心20分钟左右(2000-3000转/分)。仔细收集上清,保存过程中如有沉淀形成,应再次离心。
d.尿液:用无菌管收集,离心20分钟左右(2000-3000转/分)。仔细收集上清,保存过程中如有沉淀形成,应再次离心。胸腹水、脑脊液参照实行。
e.细胞培养上清:检测分泌性的成份时,用无菌管收集。离心20分钟左右(2000-3000转/分)。仔细收集上清。检测细胞内的成份时,用PBS(PH7.2-7.4)稀释细胞悬液,细胞浓度达到100万/ml左右。通过反复冻融,以使细胞破坏并放出细胞内成份。离心20分钟左右(2000-3000转/分)。仔细收集上清。保存过程中如有沉淀形成,应再次离心。
f.组织标本:切割标本后,称取重量。加入一定量的PBS,PH7.4。用液氮迅速冷冻保存备用。标本融化后仍然保持2-8℃的温度。加入一定量的PBS(PH7.4),用手工或匀浆器将标本匀浆充分。离心20分钟左右(2000-3000转/分)。仔细收集上清。分装后一份待检测,其余冷冻备用。
货号 名称 英文 检测范围
BPE11196 人C反应蛋白(CRP)ELISA Kit Human C-Reactive Protein,CRP ELISA Kit 0.25-40ng/ml
BPE20324 小鼠C反应蛋白(CRP)ELISA Kit MouseC-Reactive Protein,CRP ELISA Kit 0.75-120ug/ml
BPE30459 大鼠C反应蛋白(CRP)ELISA Kit Rat C-Reactive Protein,CRP ELISA Kit 0.2-32μg/ml
BPE40137 豚鼠C反应蛋白(CRP)ELISA Kit Guinea pig C-Reactive Protein,CRP ELISA Kit 0.2-32μg/ml
BPE50055 猪C反应蛋白(CRP)ELISA Kit Porcine C-reactive protein,CRP ELISA Kit 0.75-120ug/ml
BPE60031 鸡C反应蛋白(CRP)ELISA Kit Chicken C-Reactive Protein,CRP ELISA Kit 0.1-16μg/ml
BPE80190 兔子C反应蛋白(CRP)ELISA Kit rabbit C-Reactive Protein,CRP ELISA Kit 0.2-32μg/ml
BPE91171 犬C反应蛋白(CRP)ELISA Kit Canine C-Reactive Protein,CRP ELISA Kit 0.25-40ng/ml
BPE92171 牛C反应蛋白(CRP)ELISA Kit bovine C-Reactive Protein,CRP ELISA Kit 0.75-120ug/ml
BPE93180 羊C反应蛋白(CRP)ELISA Kit bovine C-Reactive Protein,CRP ELISA Kit 0.75-120ug/ml
BPE94059 虾C反应蛋白(CRP)ELISA Kit Shrimp C-Reactive Protein,CRP ELISA Kit 0.2-32μg/ml