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牛白介素4(IL-4)ELISA Kit

BPE92154 Catalogue No.
48/96T
1380.00-2580.00
检测范围:1.5-240ng/L
bovine Interleukin 4,IL-4 ELISA Kit
批间差:CV<10%
批内差:CV<8%

白细胞介素4(IL-4)主要由活化T细胞产生。IL-4对于B细胞、T细胞、肥大细胞、巨噬细胞和造细胞都有免疫调节作用。IL-4可单独维持TH-2的增殖,抗IL-2和抗IL-4 McAb(11B11)可分别抑制IL-2和IL-4刺激TH-2细胞的增殖作用。高剂量IL-4能诱导CD4-CD8+或CD4+CD8-或CD4-CD8-胸腺细胞的增殖。IL-4 增强PHA刺激T细胞释放GM-CSF和G-CSF。

1.实验原理:

本试剂盒采用竞争法检测样本中白介素4(IL-4))的含量。向预先包被了抗体的酶标孔中加入样本,再加入生物素标记的识别抗原,在37℃下孵育30min,两者与固相抗体竞争结合形成免疫复合物,经PBST洗涤除去未结合的生物素抗原,然后加入亲和素-HRP,在37℃下孵育30min,亲和素-HRP与生物素抗原结合,洗涤后结合的HRP催化TMB(四甲基联苯胺)成蓝色,随后在酸的作用下转化成黄色,在450nm波长下有吸收峰,吸光值与样本中抗原的浓度成负相关

2.试剂盒组成:

试剂盒组成

48孔配置

96孔配置

保存

说明书

1份

1份


封板膜

2片(48)

2片(96)


密封袋

1个

1个


酶标包被板

1×48

1×96

长期-20℃

标准品(冻干粉)

2支(定容至150μl)

2支(定容至150μl)

2-8℃

标准品/样品稀释液

3ml×1瓶

6ml×1瓶

2-8℃

生物素抗原(冻干粉)

1支(稀释到3ml)

1支(稀释到6ml)

长期-20℃

亲和素-HRP(浓缩液)

50μl(稀释到3ml)

100μl (稀释到6ml)

长期-20℃

生物素抗原稀释液

3ml×1瓶

6ml×1瓶

2-8℃

亲和素-HRP稀释液

2.95ml×1瓶

5.9ml×1瓶

2-8℃

显色剂A液

3ml×1瓶

6ml×1瓶

2-8℃

显色剂B液

3ml×1瓶

6ml×1瓶

2-8℃

终止液

3ml×1瓶

6ml×1瓶

2-8℃

浓缩洗涤液

(20ml*25倍)×1瓶

(20ml*25倍)×1瓶

2-8℃

备注:

1)   试剂盒中“标准品/样品稀释液”为超纯水(可用双蒸水替代),“终止液”为2M的H2SO4,洗涤液为含0.15%吐温-20的PBST,如不够可自行配制。

2) 不同公司的缓冲体系存在较大差异,请勿将本试剂盒的试剂与其他公司的试剂混用以免影响实验结果。

3)  浓缩洗涤液在低温下会有少量盐类析出,稍微加温后即会消失,不影响使用。

4)   浓缩生物素抗原和浓缩亲和素-HRP稀释前务必先离心同时应避免反复冻融

3.需要而未提供的试剂和器材

1)  37℃恒温箱。

2)  标准规格酶标仪。

3)  精密移液器及一次性吸头

4)  双蒸水或超纯水

5)  干净的试管或Eppendof管

6)  吸水纸

7)  自动洗板机或8道排枪

8)  ELISA数据处理软件,推荐使用ELISACalc

       9)  500ml烧杯的和适当量程的量筒

4.试剂准备

1)   使用前所有试剂应置于室温平衡至少30分钟。

2)  本试剂盒可以直接加样,如浓度过高,可以进行适当比例的稀释(推荐2-5倍稀释),计算时应将结果乘以稀释的倍数。

3)  洗涤液为25倍浓缩液,使用前将所有洗涤液倒入500ml或1L的烧杯中,用双蒸水定容到500ml即为工作液。

4)  标准品的稀释:先用标准品/样品稀释液将标准品冻干粉定容到150μl,然后漩涡混匀30秒即为标准品原液(24小时内用完)。取5支干净的Eppendorf管,每管加150μl的标准品稀释液,分别标记上240ng/L,120ng/L,60ng/L,30ng/L,15ng/L         .取150μl标准品原液加入标记240ng/L的管中,混匀后同样取出150μl,加入下一管,以此类推直至***一管。零孔:直接加标准品/样品稀释液。(见下图)

稀释.jpg


原液480ng/L   240ng/L    120ng/L     60ng/L     30ng/L   15ng/L



5)生物素抗原的稀释:抽取生物素抗原稀释液1ml到浓缩型生物素抗原中,漩涡混匀15秒至冻干粉完全溶解,然后将所有液体移入稀释液瓶中,再次漩涡混匀30秒即为生物素抗原工作液。

6)  亲和素-HRP的稀释:低速离心(使浓缩液全部沉到管底),将浓缩亲和素-HRP全部移入相应稀释液中然后漩涡混匀30秒即为亲和素-HRP工作液

5.详细操作程序

1) 使用前请先将试剂盒在室温下平衡半小时。

2) 空白孔不加样,只加显色剂A,B和终止液用于调零。

3)标准品孔:每孔加入稀释好的标准品50μl,零孔加入标准品/样品稀释液50μl,然后加入生物素抗原工作液50μl(零孔必须要做,并将其作为标曲的***一个点)

4)样品孔:加入样品50μl(推荐直接加样,浓度高可以用样品稀释液稀释2-5倍),然后加入生物素抗原工作液50μl。

5) 轻轻摇晃,盖上封板膜,37℃培养箱中孵育30min。

6) 将25倍浓缩洗涤液用蒸馏水25倍稀释后备用。

7) ***次洗涤:小心揭掉封板膜,弃去液体,甩干,每孔加满洗涤液,静置30秒后弃去,如此重复5次,拍干。

8) 加入50μl亲和素-HRP到标准品孔和样品孔中,轻轻摇晃,盖上封板膜,37℃培养箱中孵育30min。

9)  第二次洗涤:小心揭掉封板膜,弃去液体,甩干,每孔加满洗涤液,静置30秒后弃去,如此重复5次,拍干。

10)  显色:每孔先加入显色剂A 50μl,再加入显色剂B 50μl,轻轻震荡混匀,37℃避光显色10分钟。

11)  终止:每孔加终止液50μl,终止反应(此时蓝色立转黄色).

12)  测定:以空白孔调零,450nm波长依序测量各孔的吸光度(OD值)。 测定应在加终止液后10分钟以内进行。

13)  计算:根据浓度和OD值算出标准曲线的回归方程,建议用专用计算软件进行计算,推荐使用ELISAcalc进行计算,拟合模型选用logistic曲线(四参数)。




局限性

1)实验人员,操作习惯、 洗涤技术、孵育温度、显色时间及试剂盒保存时间等因素的改变都会影响实验的效果。
2)本试剂盒已经尽力去除或降低了生物学样本中内源性干扰因素,但非所有可能的影响因素全部排出。
3)样本浓度仅在盒子设 计的检测范围内可以检测,超出范围无法检测。
4)样本反复冻融或榕血会影响实验结果。

必要说明

1)本试剂盒用于科学研究,不能用于诊断治疗。
2)试剂盒中化学试剂具有潜在危害,操作时请佩戴白大衣、我胶手套、安全眼镜等防护设施。
3)试剂盒中的终止液为酸性溶液,在使用终止液时,请佩戴防护服,及防护眼睛、手及西部的设施。以避兔试剂接触皮肤和眼睛。如不慎接触,请立即用大量清水清洗,及时就医。
4)请不要使用其他批号或其他来源的试剂替代本试剂盒中的试剂。
5)请不要使用过期的试剂。
6)在试剂盒的贮存或孵育过程请避免强光照射。
7)在操作试剂盒或处理样本的区域请不要饮食。
8)不要让试剂或样本接触皮肤和粘膜,操作试剂盒或处理样本时请佩戴乳胶或一次性手套。
9)显色底物避免与氧化试剂和金属接触,显色底物在使用之前必须平衡至室温。
10)为了避免微生物的精染,以及试剂与样本间的交叉宿染,请使用一次性枪头。
11)使用干净的容器配制试剂,试剂的准备必须使用蒸饱水或去离子水。
12)暴露于酸性环境会抑制结合。
13)不同公司的缓冲体系存在较大差异,请勿将本试剂盒的试剂与其他公司的试剂混用。
14)浓缩恍涤液在低温下会有少量盐类析出,稍微加温后即会消失,不影响使用。
15)浓缩生物素抗原和浓缩亲和素-HRP:稀释前务必先离心同时应避免反复冻融。
16)样本可能含有传染性病原体,处理样本和可能的污染材料的***方法121.5C,60min。实验剩余试剂、样本的处理请遵循生化实验室废弃物处理的相关规定进行。

样本处理

1) 标本采集后尽早进行提取,提取按相关文献进行,提取后应尽快进行实验。若不能马上进行试验,可将标本放于-20℃保存,但应避免反复冻融。
2) 血清:室温血液自然凝固10-20分钟,离心20分钟左右(2000-3000转/分)。仔细收集上清,检测前如有沉淀,应再次离心。
3) 血浆:应根据检测指标的要求选择EDTA或枸橼酸钠或肝素作为抗凝剂,混合10-20分钟后,离心20分钟左右(2000-3000转/分)。仔细收集上请,检测前如有沉淀,应再次离心。
4) 尿液:用无菌管收集,离心20分钟左右(2000-3000转/分)。仔细收集上清,保存过程中如有沉淀形成,应再次离心。胸腹水、脑脊液参照实行。
5) 细胞培养上清:检测分泌性的成份时,用无菌管收集。离心20分钟左右(2000-3000转/分)。仔细收集上清。检测细胞内的成份时,用PBS(PH7.2-7.4)稀释细胞悬液,细胞浓度达到100万/ml左右。通过反复冻融,以使细胞破坏并放出细胞内成份。离心20分钟左右(2000-3000转/分)。仔细收集上清。保存过程中如有沉淀形成,应再次离心。
6) 组织标本:切割标本后,称
取重量(1g),加入一定量(9ml)的PBS(PH7.4)。用手工或匀浆器将标本匀浆充分。离心20分钟左右(2000-3000转/分)。仔细收集上清。分装后一份待检测,其余冷冻备用。样本不足1g,按照1:9加入PBS后匀浆即可。




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