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牛肿瘤坏死因子α(TNF-α) ELISA Kit

BPE92091 Catalogue No.
48/96T
1380.00-2580.00
检测范围:4-640ng/L
bovine Tumor necrosis factor α,TNFα ELISA Kit
批间差:CV<10%
批内差:CV<8%

肿瘤坏死因子α(tumor      necrosis factor      α,TNF-α)是一种主要由巨噬细胞和单核细胞产生的促炎细胞因子,并参与正常炎症反应和免疫反应。TNF-α在许多病理状态下产生增多,包括败血症、恶性肿瘤、心脏衰竭和慢性炎性疾病。在重症类风湿关节炎患者的血液及关节中都可发现肿瘤坏死因子增多。大剂量TNF-α可引起恶病质,患者呈进行性消瘦,因而TNF-α又称恶病质素。

1.实验原理:

本试剂盒采用竞争法检测样本中肿瘤坏死因子α(TNF-α)的含量。向预先包被了抗体的酶标孔中加入样本,再加入生物素标记的识别抗原,在37℃下孵育30min,两者与固相抗体竞争结合形成免疫复合物,经PBST洗涤除去未结合的生物素抗原,然后加入亲和素-HRP,在37℃下孵育30min,亲和素-HRP与生物素抗原结合,洗涤后结合的HRP催化TMB(四甲基联苯胺)成蓝色,随后在酸的作用下转化成黄色,在450nm波长下有吸收峰,吸光值与样本中抗原的浓度成负相关

2.试剂盒组成:

试剂盒组成

48孔配置

96孔配置

保存

说明书

1份

1份


封板膜

2片(48)

2片(96)


密封袋

1个

1个


酶标包被板

1×48

1×96

长期-20℃

标准品(冻干粉)

2支(定容至150μl)

2支(定容至150μl)

2-8℃

标准品/样品稀释液

3ml×1瓶

6ml×1瓶

2-8℃

生物素抗原(冻干粉)

1支(稀释到3ml)

1支(稀释到6ml)

长期-20℃

亲和素-HRP(浓缩液)

50μl(稀释到3ml)

100μl (稀释到6ml)

长期-20℃

生物素抗原稀释液

3ml×1瓶

6ml×1瓶

2-8℃

亲和素-HRP稀释液

2.95ml×1瓶

5.9ml×1瓶

2-8℃

显色剂A液

3ml×1瓶

6ml×1瓶

2-8℃

显色剂B液

3ml×1瓶

6ml×1瓶

2-8℃

终止液

3ml×1瓶

6ml×1瓶

2-8℃

浓缩洗涤液

(20ml*25倍)×1瓶

(20ml*25倍)×1瓶

2-8℃

备注:

1)   试剂盒中“标准品/样品稀释液”为超纯水(可用双蒸水替代),“终止液”为2M的H2SO4,洗涤液为含0.15%吐温-20的PBST,如不够可自行配制。

2) 不同公司的缓冲体系存在较大差异,请勿将本试剂盒的试剂与其他公司的试剂混用以免影响实验结果。

3)  浓缩洗涤液在低温下会有少量盐类析出,稍微加温后即会消失,不影响使用。

4)   浓缩生物素抗原和浓缩亲和素-HRP稀释前务必先离心同时应避免反复冻融

3.需要而未提供的试剂和器材

1)  37℃恒温箱。

2)  标准规格酶标仪。

3)  精密移液器及一次性吸头

4)  双蒸水或超纯水

5)  干净的试管或Eppendof管

6)  吸水纸

7)  自动洗板机或8道排枪

8)  ELISA数据处理软件,推荐使用ELISACalc

       9)  500ml烧杯的和适当量程的量筒

4.试剂准备

1)   使用前所有试剂应置于室温平衡至少30分钟。

2)  本试剂盒可以直接加样,如浓度过高,可以进行适当比例的稀释(推荐2-5倍稀释),计算时应将结果乘以稀释的倍数。

3)  洗涤液为25倍浓缩液,使用前将所有洗涤液倒入500ml或1L的烧杯中,用双蒸水定容到500ml即为工作液。

4)  标准品的稀释:先用标准品/样品稀释液将标准品冻干粉定容到150μl,然后漩涡混匀30秒即为标准品原液(24小时内用完)。取5支干净的Eppendorf管,每管加150μl的标准品稀释液,分别标记上480ng/L,240ng/L,120ng/L,60ng/L    ,30ng/L .取150μl标准品原液加入标记480ng/L    的管中,混匀后同样取出150μl,加入下一管,以此类推直至***一管。零孔:直接加标准品/样品稀释液。(见下图)稀释.jpg

原液1280ng/L    640ng/L   320ng/L    160ng/L     80ng/L     40ng/L


5)生物素抗原的稀释:抽取生物素抗原稀释液1ml到浓缩型生物素抗原中,漩涡混匀15秒至冻干粉完全溶解,然后将所有液体移入稀释液瓶中,再次漩涡混匀30秒即为生物素抗原工作液。

6)  亲和素-HRP的稀释:低速离心(使浓缩液全部沉到管底),将浓缩亲和素-HRP全部移入相应稀释液中然后漩涡混匀30秒即为亲和素-HRP工作液

5.详细操作程序

1) 使用前请先将试剂盒在室温下平衡半小时。

2) 空白孔不加样,只加显色剂A,B和终止液用于调零。

3)标准品孔:每孔加入稀释好的标准品50μl,零孔加入标准品/样品稀释液50μl,然后加入生物素抗原工作液50μl(零孔必须要做,并将其作为标曲的***一个点)

4)样品孔:加入样品50μl(推荐直接加样,浓度高可以用样品稀释液稀释2-5倍),然后加入生物素抗原工作液50μl。

5) 轻轻摇晃,盖上封板膜,37℃培养箱中孵育30min。

6) 将25倍浓缩洗涤液用蒸馏水25倍稀释后备用。

7)***次洗涤:小心揭掉封板膜,弃去液体,甩干,每孔加满洗涤液,静置30秒后弃去,如此重复5次,拍干。

8)加入50μl亲和素-HRP到标准品孔和样品孔中,轻轻摇晃,盖上封板膜,37℃培养箱中孵育30min。

9)  第二次洗涤:小心揭掉封板膜,弃去液体,甩干,每孔加满洗涤液,静置30秒后弃去,如此重复5次,拍干。

10)  显色:每孔先加入显色剂A 50μl,再加入显色剂B 50μl,轻轻震荡混匀,37℃避光显色10分钟。

11)  终止:每孔加终止液50μl,终止反应(此时蓝色立转黄色).

12)  测定:以空白孔调零,450nm波长依序测量各孔的吸光度(OD值)。 测定应在加终止液后10分钟以内进行。

13)  计算:根据浓度和OD值算出标准曲线的回归方程,建议用专用计算软件进行计算,推荐使用ELISAcalc进行计算,拟合模型选用logistic曲线(四参数)。




局限性

1)实验人员,操作习惯、 洗涤技术、孵育温度、显色时间及试剂盒保存时间等因素的改变都会影响实验的效果。
2)本试剂盒已经尽力去除或降低了生物学样本中内源性干扰因素,但非所有可能的影响因素全部排出。
3)样本浓度仅在盒子设 计的检测范围内可以检测,超出范围无法检测。
4)样本反复冻融或榕血会影响实验结果。

必要说明

1)本试剂盒用于科学研究,不能用于诊断治疗。
2)试剂盒中化学试剂具有潜在危害,操作时请佩戴白大衣、我胶手套、安全眼镜等防护设施。
3)试剂盒中的终止液为酸性溶液,在使用终止液时,请佩戴防护服,及防护眼睛、手及西部的设施。以避兔试剂接触皮肤和眼睛。如不慎接触,请立即用大量清水清洗,及时就医。
4)请不要使用其他批号或其他来源的试剂替代本试剂盒中的试剂。
5)请不要使用过期的试剂。
6)在试剂盒的贮存或孵育过程请避免强光照射。
7)在操作试剂盒或处理样本的区域请不要饮食。
8)不要让试剂或样本接触皮肤和粘膜,操作试剂盒或处理样本时请佩戴乳胶或一次性手套。
9)显色底物避免与氧化试剂和金属接触,显色底物在使用之前必须平衡至室温。
10)为了避免微生物的精染,以及试剂与样本间的交叉宿染,请使用一次性枪头。
11)使用干净的容器配制试剂,试剂的准备必须使用蒸饱水或去离子水。
12)暴露于酸性环境会抑制结合。
13)不同公司的缓冲体系存在较大差异,请勿将本试剂盒的试剂与其他公司的试剂混用。
14)浓缩恍涤液在低温下会有少量盐类析出,稍微加温后即会消失,不影响使用。
15)浓缩生物素抗原和浓缩亲和素-HRP:稀释前务必先离心同时应避免反复冻融。
16)样本可能含有传染性病原体,处理样本和可能的污染材料的***方法121.5C,60min。实验剩余试剂、样本的处理请遵循生化实验室废弃物处理的相关规定进行。

样本处理

1) 标本采集后尽早进行提取,提取按相关文献进行,提取后应尽快进行实验。若不能马上进行试验,可将标本放于-20℃保存,但应避免反复冻融。
2) 血清:室温血液自然凝固10-20分钟,离心20分钟左右(2000-3000转/分)。仔细收集上清,检测前如有沉淀,应再次离心。
3) 血浆:应根据检测指标的要求选择EDTA或枸橼酸钠或肝素作为抗凝剂,混合10-20分钟后,离心20分钟左右(2000-3000转/分)。仔细收集上请,检测前如有沉淀,应再次离心。
4) 尿液:用无菌管收集,离心20分钟左右(2000-3000转/分)。仔细收集上清,保存过程中如有沉淀形成,应再次离心。胸腹水、脑脊液参照实行。
5) 细胞培养上清:检测分泌性的成份时,用无菌管收集。离心20分钟左右(2000-3000转/分)。仔细收集上清。检测细胞内的成份时,用PBS(PH7.2-7.4)稀释细胞悬液,细胞浓度达到100万/ml左右。通过反复冻融,以使细胞破坏并放出细胞内成份。离心20分钟左右(2000-3000转/分)。仔细收集上清。保存过程中如有沉淀形成,应再次离心。
6) 组织标本:切割标本后,称
取重量(1g),加入一定量(9ml)的PBS(PH7.4)。用手工或匀浆器将标本匀浆充分。离心20分钟左右(2000-3000转/分)。仔细收集上清。分装后一份待检测,其余冷冻备用。样本不足1g,按照1:9加入PBS后匀浆即可。


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