人软骨寡聚蛋白(COMP)ELISA Kit/Human cartilage oligomeric protein,COMP ELISA Kit
- 48/96T
- 1380.00-2580.00
- 0.05-8μg/ml
- 0.05μg/ml
- 批间差：CV＜12%
- 批内差：CV＜10%
软骨寡聚基质蛋白(Cartilage Oligomeric Matrix Protein,COMP)是近年来新发现的一种细胞外基质蛋白,属于凝血栓蛋白家族。此蛋白含有5个分子量为87kD的亚单位,通过链间二硫键连接成分子量为435kD的五聚体蛋白。此种连接是通过亚单位内的氨基酸区实现的,另外还有4个类表皮生成因子的重叠与7个TSP-3重叠,TSP-3重叠内包含一类调钙蛋白的钙离子结合区基序,最后是一个羟基球型区。凝血栓蛋白家族目前已知有5个成员:TSP-1、TSP-2、TSP-3、TSP-4及COMP (也有人称作TSP-5)。这些同源蛋白在其中央区域内都有2型(类表皮生长因子)及3型(类调钙蛋白)重叠。其同源性在羟基端的球型区内表现最为显著,而氨基端的氨基酸序列则不明显。TSP-1与TSP-2为三聚体,结构上包含有前胶原样的氨基端区域。TSP-3、TSP-4 与COMP为结构，上相类似的五聚体,缺乏TSP-1和TSP-2所具有的前胶原样区域。
1.实验方法：
本试剂盒采用竞争法检测样本中软骨寡聚蛋白(COMP)的含量。向预先包被了抗体的酶标孔中加入样本，再加入生物素标记的识别抗原，在37℃下孵育30min，两者与固相抗体竞争结合形成免疫复合物，经PBST洗涤除去未结合的生物素抗原，然后加入亲和素-HRP，在37℃下孵育30min,亲和素-HRP与生物素抗原结合，洗涤后结合的HRP催化TMB（四甲基联苯胺）成蓝色，随后在酸的作用下转化成黄色，在450nm波长下有吸收峰，吸光值与样本中抗原的浓度成负相关
2.试剂盒组成：
试剂盒组成 | 48孔配置 | 96孔配置 | 保存 |
说明书 | 1份 | 1份 | |
封板膜 | 2片（48） | 2片（96） | |
密封袋 | 1个 | 1个 | |
酶标包被板 | 1×48 | 1×96 | 长期-20℃ |
标准品（冻干粉） | 2支（定容至150μl） | 2支（定容至150μl） | 2-8℃ |
标准品/样品稀释液 | 3ml×1瓶 | 6ml×1瓶 | 2-8℃ |
生物素抗原（冻干粉） | 1支(稀释到3ml） | 1支(稀释到6ml） | 长期-20℃ |
亲和素-HRP（浓缩液） | 50μl(稀释到3ml） | 100μl (稀释到6ml） | 长期-20℃ |
生物素抗原稀释液 | 3ml×1瓶 | 6ml×1瓶 | 2-8℃ |
亲和素-HRP稀释液 | 2.95ml×1瓶 | 5.9ml×1瓶 | 2-8℃ |
显色剂A液 | 3ml×1瓶 | 6ml×1瓶 | 2-8℃ |
显色剂B液 | 3ml×1瓶 | 6ml×1瓶 | 2-8℃ |
终止液 | 3ml×1瓶 | 6ml×1瓶 | 2-8℃ |
浓缩洗涤液 | （20ml*25倍）×1瓶 | （20ml*25倍）×1瓶 | 2-8℃ |
备注：
1) 试剂盒中“标准品/样品稀释液”为超纯水（可用双蒸水替代），“终止液”为2M的H2SO4，洗涤液为含0.15%吐温-20的PBST，如不够可自行配制。
2) 不同公司的缓冲体系存在较大差异，请勿将本试剂盒的试剂与其他公司的试剂混用以免影响实验结果。
3) 浓缩洗涤液在低温下会有少量盐类析出，稍微加温后即会消失，不影响使用。
4) 浓缩生物素抗原和浓缩亲和素-HRP稀释前务必先离心同时应避免反复冻融
3.需要而未提供的试剂和器材
1) 37℃恒温箱。 2) 标准规格酶标仪。
3) 精密移液器及一次性吸头 4) 双蒸水或超纯水
5) 干净的试管或Eppendof管 6) 吸水纸
7) 自动洗板机或8道排枪 8) ELISA数据处理软件，推荐使用ELISACalc
9) 500ml烧杯的和适当量程的量筒
4.试剂准备
1) 使用前所有试剂应置于室温平衡至少30分钟。
2) 本试剂盒可以直接加样，如浓度过高，可以进行适当比例的稀释（推荐2-5倍稀释），计算时应将结果乘以稀释的倍数。
3) 洗涤液为25倍浓缩液，使用前将所有洗涤液倒入500ml或1L的烧杯中，用双蒸水定容到500ml即为工作液。
4) 标准品的稀释：取5支干净的Eppendorf管，每管加150μl的标准品稀释液，分别标记上标准品1，标准品2，标准品3，标准品4，标准品5.取150μl标准品原液加入标记标准品1 的管中，混匀后同样取出150μl，加入下一管，以此类推直至***一管。零孔：直接加标准品/样品稀释液。（见下图）
原液 标准品1 标准品2 标准品3 标准品4 标准品5
5)生物素抗原的稀释：抽取生物素抗原稀释液1ml到浓缩型生物素抗原中，漩涡混匀15秒至冻干粉完全溶解，然后将所有液体移入稀释液瓶中,再次漩涡混匀30秒即为生物素抗原工作液。
6) 亲和素-HRP的稀释：低速离心（使浓缩液全部沉到管底），将浓缩亲和素-HRP全部移入相应稀释液中然后漩涡混匀30秒即为亲和素-HRP工作液。
5.详细操作程序
1) 使用前请先将试剂盒在室温下平衡半小时。
2) 空白孔不加样，只加显色剂A，B和终止液用于调零。
3)标准品孔：每孔加入稀释好的标准品50μl，零孔加入标准品/样品稀释液50μl，然后加入生物素抗原工作液50μl(零孔必须要做，并将其作为标曲的***一个点)。
4)样品孔：加入样品50μl（推荐直接加样，浓度高可以用样品稀释液稀释2-5倍），然后加入生物素抗原工作液50μl。
5) 轻轻摇晃，盖上封板膜，37℃培养箱中孵育30min。
6) 将25倍浓缩洗涤液用蒸馏水25倍稀释后备用。
7) ***次洗涤：小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30秒后弃去，如此重复5次，拍干。
8) 加入50μl亲和素-HRP到标准品孔和样品孔中，轻轻摇晃，盖上封板膜，37℃培养箱中孵育30min。
9) 第二次洗涤：小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30秒后弃去，如此重复5次，拍干。
10) 显色：每孔先加入显色剂A 50μl，再加入显色剂B 50μl，轻轻震荡混匀，37℃避光显色10分钟。
11) 终止：每孔加终止液50μl，终止反应（此时蓝色立转黄色).
12) 测定：以空白孔调零，450nm波长依序测量各孔的吸光度（OD值）。 测定应在加终止液后10分钟以内进行。
13) 计算：根据浓度和OD值算出标准曲线的回归方程，建议用专用计算软件进行计算，推荐使用ELISAcalc进行计算，拟合模型选用logistic曲线（四参数）。
