多胺氧化酶（PAO）测定试剂盒（微量法）

需自备的仪器和用品：                                                 

酶标仪、台式离心机、可调式移液器、96孔板、研钵、冰和蒸馏水。

试剂组成和配制：                                                       

试剂一：液体120mL×1瓶，4℃保存；

试剂二：液体3mL×1瓶，4℃保存；

试剂三：液体1.5mL×1瓶，4℃保存；

试剂四：液体1.5mL×1瓶，4℃保存。

粗酶液提取：                                                          

1.       组织：按照组织质量（g）：试剂一体积(mL)为1：5~10的比例（建议称取约0.1g组织，加入1mL试剂一）进行冰浴匀浆，然后10000g，4℃离心20min，取上清，置冰上待测。

2.       细菌、真菌：按照细胞数量（10⁴个）：试剂一体积（mL）为500~1000：1的比例（建议500万细胞加入1mL试剂一），冰浴超声波破碎细胞（功率300w，超声3秒，间隔7秒，总时间3min）；然后10000g，4℃，离心10min，取上清置于冰上待测。

3.       血清等液体：直接测定。

测定步骤：                                                            

1、  酶标仪预热30min以上，调节波长至550nm。

2、  样本测定

PAO活性计算：                                                            

（1）按样本蛋白浓度计算：

单位定义：每mg组织蛋白在每mL反应体系中每分钟A550变化0.001为一个酶活力单位。

PAO（U/mg prot）＝ΔA×V反总÷（V样×Cpr）÷0.001÷T =333.33×ΔA÷Cpr

（2）按样本鲜重计算：

单位定义：每g组织在每mL反应体系中每分钟A550变化0.001为一个酶活力单位。

PAO（U/g 鲜重）＝ΔA×V反总÷(W× V样÷V样总)÷0.001÷T =333.33×ΔA÷W

（3）按细菌或细胞密度计算：

单位定义：每1万个细菌或细胞在每mL反应体系中每分钟A550变化0.001为一个酶活力单位。

PAO（U/10⁴ cell）＝ΔA×V反总÷(500×V样÷V样总)÷0.001÷T =0.667×ΔA

（4）按液体体积计算

单位的定义：每mL液体样本在每mL反应体系中每分钟A550变化0.001为一个酶活力单位。

PAO（U/mL）=ΔA×V反总÷V样÷0.001÷T =333.33×ΔA

V反总：反应体系总体积，0.2mL；V样：加入样本体积，0.02 mL；V样总：加入提取液体积，1 mL；T：反应时间，30 min；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，g；500：细菌或细胞总数，500万。