还原性谷胱甘肽测定试剂盒（微量法）

自备仪器和用品：                                                     

低温离心机、水浴锅、可调节移液器、可见分光光度计/酶标仪、微量玻璃比色皿/96孔板、和蒸馏水。

试剂组成和配制：                                                     

试剂一：液体×1瓶，4℃保存。

试剂二：液体×1瓶，4℃保存。

试剂三：液体×1瓶，4℃避光保存。

粗酶液提取：                                                         

1.       组织：按照组织质量（g）：试剂一体积(mL)为1：5~10的比例（建议称取约0.1g组织，加入1mL试剂一）进行冰浴匀浆。8000g，4℃离心10min，取上清置冰上待测。

2.       细菌、真菌：按照细胞数量（10⁴个）：试剂一体积（mL）为500~1000：1的比例（建议500万细胞加入1mL试剂一），冰浴超声波破碎细胞（功率300w，超声3秒，间隔7秒，总时间3min）；然后8000g，4℃，离心10min，取上清置于冰上待测。

3.       血清等液体：直接测定。

GSH测定操作：                                                      

1. 分光光度计/酶标仪预热30min，调节波长到412 nm，蒸馏水调零。

2. 试剂二置于25℃（一般物种）或者37℃（哺乳动物）水浴中保温30min。

3. 空白管：取微量玻璃比色皿或96孔板，依次加入20μL蒸馏水，140μL试剂二，40μL试剂三，混匀静置2min后测定412 nm吸光度A1。

4. 测定管：取微量玻璃比色皿或96孔板，依次加入20μL上清液，140μL试剂二，40μL试剂三，混匀静置2min后测定412 nm吸光度A2。

注意：空白管只需要测定一次。

GSH含量计算公式：                                                  

GSH标准曲线公式：y=1.5 x（x为GSH浓度，μ mol /mL；y为吸光值）

a.使用微量石英比色皿测定的计算公式如下

（1）按蛋白浓度计算

GSH（μ mol/ mg prot）=(A2－A1) ÷1.5×V样÷（V样×Cpr） =0.667×(A2－A1) ÷Cpr

（2）按样本质量计算

GSH（μ mol/g 鲜重）=(A2－A1) ÷1.5×V样÷(V样÷V样总×W)=0.667×(A2－A1) ÷W

（3）按细胞数量计算

GSH（μ mol /10⁴ cell）=(A2－A1) ÷1.5×V样÷(V样÷V样总×细胞数量)=0.667×(A2－A1) ÷细胞数量

（4）按液体体积计算

GSH（μ mol/ mL）=(A2－A1) ÷1.5×V样÷V样 =0.667×(A2－A1)

V反总：反应总体积，0.2mL；V样总：上清液总体积，1 mL；V样：加入反应体系中上清液体积，20μL=0.02 mL；Cpr：上清液蛋白质浓度，mg/mL；W：样品质量

b.使用96孔板测定的计算公式如下

GSH标准曲线公式：y=0.75x（x为GSH浓度，μ mol /mL；y为吸光值）

（1）按蛋白浓度计算

GSH（μ mol/ mg prot）=(A2－A1) ÷0.75×V样÷V样÷Cpr =1.334×(A2－A1) ÷Cpr

（2）按样本鲜重计算

GSH（μ mol/g 鲜重）=(A2－A1) ÷0.75×V样÷(V样÷V样总×W)=1.334×(A2－A1) ÷W

（3）按细胞数量计算

GSH（μ mol /10⁴ cell）=(A2－A1) ÷0.75×V样÷(V样÷V样总×细胞数量)=1.334×(A2－A1) ÷细胞数量

（4）按液体体积计算

GSH（μ mol/ mL）=(A2－A1) ÷0.75×V反总÷V样 =1.334×(A2－A1)

V样总：上清液总体积，1mL；V样：加入反应体系中上清液体积，20μL=0.02 mL；Cpr：上清液蛋白质浓度，mg/mL；W：样品质量，g。

注意事项：                                                            

1.       试剂一中含有蛋白质沉淀剂，因此上清液不能用于蛋白浓度测定。

2.       最低检出限为0.011mmol/L。