酸性磷酸酶（ACP）测定试剂盒（微量法）

自备仪器和用品：                                                       

酶标仪、96孔板、台式离心机、水浴锅、可调式移液器和蒸馏水。

试剂组成和配制：                                                       

试剂一：液体60 mL×2瓶，4℃保存。

试剂二：液体50 mL×1瓶，4℃保存。

试剂三：液体50 mL×1瓶，4℃保存。

粗酶液提取：                                                         

1.       组织：按照组织质量（g）：试剂一体积(mL)为1：5~10的比例（建议称取约0.1g组织，加入1 mL试剂一）进行冰浴匀浆，4℃、10000g离心10 min，取上清液待测。

2.       细菌或细胞：按照细菌或细胞数量（10⁴个）：试剂一体积（mL）为500~1000：1的比例（建议500万细胞加入1 mL试剂一），冰浴超声波破碎细胞（功率300w，超声3秒，间隔7秒，总时间3 min）；然后10000g，4℃，离心10min，取上清置于冰上待测。

3.       血液可直接测定，或者适当稀释后测定。

测定：                                                                 

1. 酶标仪预热30 min，调节波长到405 nm。

2. 在 EP 管中加入下列试剂

混匀，吸取 200µL 加入96 孔板中，405 nm 下测定各管吸光值。ΔA=A测定管-A对照管。

注意：每个测定管需做一个对照管。

ACP活性计算：                                                       

标准曲线 y = 7.3336x + 0.0179；R² = 0.9996；x为标准品浓度（μmol/mL），y为吸光值ΔA。

1. 血液中ACP活性计算

活性单位定义：30℃中每毫升血液每分钟催化产生1μmol 4-硝基苯酚定义为1个酶活单位。

ACP活力(μmol/min/mL)=（ΔA-0.0179）÷7.3336 ×V反总÷T÷V样

= 0.4545 ×（ΔA-0.0179）

2. 组织、细菌或细胞中ACP活性计算

（1）按照蛋白浓度计算

活性单位定义：30℃中每毫克蛋白每分钟催化产生1 μmol 4-硝基苯酚定义为1个酶活单位。

ACP活力(μmol/min/mg prot)= (ΔA-0.0179)÷7.3336 ×V反总÷T÷(V样×Cpr)

=0.4545 ×（ΔA-0.0179）÷Cpr

（2）按照样本质量计算

活性单位定义：30℃中每克组织每分钟催化产生1 μ mol 4-硝基苯酚定义为1个酶活单位。

ACP活力 (μmol/min/g 鲜重)=(ΔA-0.0179)÷7.3336 ×V反总÷T÷(W×V 样÷V 样总)

= 0.4545 ×（ΔA-0.0179）÷W

（3）按照细菌或细胞数量计算

活性单位定义：30℃中每10⁴个细菌或细胞每分钟催化产生1 μ mol 4-硝基苯酚定义为1个酶活单位。

ACP 活力(μmol/min/10⁴ cell)=(ΔA-0.0179)÷7.3336 ×V反总÷T÷（细胞数量×V 样÷V 样总）

= 0.4545 ×（ΔA-0.0179）÷细胞数量

V反总：反应体系总体积（mL），1 mL； W ：样品质量，g； V样：加入反应体系中样本体积（mL），0.01 mL；V样总：提取液体积，1 mL；T：反应时间（min），30 min；500：细胞或细菌总数，500万。

注意事项：                                                            

ACP不稳定，尤其在37℃和pH大于7的条件下活力丧失快，因此酸性磷酸酶样品一般需当天准备；血清样品中，每毫升血清中加入10mg柠檬酸氢二钠或者5mg硫酸氢钠，使pH降至6.5以下，或5ml血清加入30%醋酸溶液2～3滴，置于4℃可保存1周。