胃蛋白酶（Pepsin）测定试剂盒（微量法）

自备仪器和用品：                                                         

可见分光光度计/酶标仪、微量玻璃比色皿/96孔板、台式离心机、水浴锅、可调式移液器、研钵、冰和蒸馏水。

试剂组成和配制：                                                      

试剂一：液体100mL×1瓶，4℃保存。

试剂二：液体20mL×1瓶，4℃保存。

试剂三：粉剂×1瓶，4℃避光保存。临用前加入10mL试剂二充分溶解。

试剂四：粉剂×1瓶，4℃保存。临用前加入10mL蒸馏水充分溶解。

试剂五：粉剂×1瓶，4℃保存。临用前加入15mL蒸馏水充分溶解。

试剂六：液体3.3mL×1瓶，4℃保存。

标准品：液体1.27mL×1支，0.5μmol/mL酪氨酸标准溶液浓度4℃保存。

粗酶液提取：                                                          

组织样品：按照组织质量（g）：试剂一体积(mL)为1：5~10的比例（建议称取约0.1g组织，加入1mL试剂一）冰浴匀浆，8000g，4℃离心10min，取上清，即粗酶液。

测定步骤：                                                            

1.分光光度计/酶标仪预热30min，调节波长到580 nm，蒸馏水调零。

2. 试剂三和试剂四置于37℃水浴预热30min。

3. 标准管：取微量玻璃比色皿/96孔板，加入20μL标准品，40μL试剂二，120μL试剂五，20μL试剂六，混匀后室温静置20min，于580 nm测光吸收，记为A标准管。

4. 空白管：取微量玻璃比色皿/96孔板，加入20μL蒸馏水，40μL试剂二，120μL试剂五，20μL试剂六，混匀后室温静置20min，于 580 nm测光吸收，记为A标准空白管。

5. 对照管：取 EP管，加入100 μL蒸馏水，置于37℃水浴保温10min；加入100μL试剂四，盖紧后摇匀1min；加入20μL粗酶液，混匀后8000g 4℃离心10分钟取上清；在微量玻璃比色皿/96孔板加入上清液20μL，再加入40μL试剂二，120μL试剂五，20μL试剂六，混匀后室温静置20min，于580 nm测光吸收，记为A空白管。

6. 测定管：取 EP管，加入20μL粗酶液，100μL试剂三，置于37℃水浴保温10min；加入100μL试剂四，盖紧后摇匀1min；8000g 4℃离心10分钟取上清；在微量玻璃比色皿/96孔板加入上清液20μL，再加入40μL试剂二，120μL试剂五，20μL试剂六，混匀后室温静置20min，于 580 nm测光吸收，记为A测定管。

注意：空白管和标准管只需要测定一次。

计算公式：                                                               

a.使用微量玻璃比色皿测定的计算公式如下

（1）按蛋白浓度计算

活性单位定义：37℃每毫克蛋白每分钟催化血红蛋白水解生成1nmol酪氨酸为1个酶活单位。

胃蛋白酶活性（nmol/min/mg prot）= C标准品×（A测定管－A对照管）÷（A标准管－A空白管）×稀释倍数÷（Cpr×V1）÷T

=27500×（A测定管－A对照管）÷（A标准管－A空白管）÷Cpr

（2）按样本质量计算

活性单位定义：37℃每克组织每分钟催化血红蛋白水解生成1nmol酪氨酸为1个酶活单位。

胃蛋白酶活性（nmol/min/g 鲜重）= C标准品×（A测定管－A对照管）÷（A标准管－A空白管）×稀释倍数÷（W×V1÷V2）÷T

=27500×（A测定管－A对照管）÷（A标准管－A空白管）÷W

C标准品：标准品浓度，0.5 μmol/mL酪氨酸；稀释倍数：（20+100+100）÷20=11；Cpr：粗酶液蛋白质浓度（mg/mL），需要另外测定；V1：加入反应体系中粗酶液体积（mL），20μL=2×10^-2mL；W：组织质量（g）；V2：粗酶液总体积（mL），1mL；T：催化反应时间（min），10min。

b.使用96孔板测定的计算公式如下

（（1）按蛋白浓度计算

活性单位定义：37℃每毫克蛋白每分钟催化血红蛋白水解生成1nmol酪氨酸为1个酶活单位。

胃蛋白酶活性（nmol/min/mg prot）= C标准品×（A测定管－A对照管）÷（A标准管－A空白管）×稀释倍数÷（Cpr×V1）÷T

=27500×（A测定管－A对照管）÷（A标准管－A空白管）÷Cpr

（2）按样本质量计算

活性单位定义：37℃每克组织每分钟催化血红蛋白水解生成1nmol酪氨酸为1个酶活单位。

胃蛋白酶活性（nmol/min/g 鲜重）= C标准品×（A测定管－A对照管）÷（A标准管－A空白管）×稀释倍数÷（W×V1÷V2）÷T

=27500×（A测定管－A对照管）÷（A标准管－A空白管）÷W

C标准品：标准品浓度，0.5 μmol/mL酪氨酸；稀释倍数：（20+100+100）÷20=11；Cpr：粗酶液蛋白质浓度（mg/mL），需要另外测定；V1：加入反应体系中粗酶液体积（mL），20μL=2×10^-2mL；W：组织质量（g）；V2：粗酶液总体积（mL），1mL；T：催化反应时间（min），10min。

注意事项                                                               

试剂三、试剂四、试剂五临用前配制，配制好用不完的试剂4℃可保存一周。