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小鼠谷氨酸(Glu)ELISA Kit / Mouse Glutamate,Glu ELISA Kit

BPE20294 Catalogue No.
48/96T
1380.00-2580.00
谷氨酸(Glu),试剂盒,ELISA
2-320μmol/L
批间差:CV<12%
批内差:CV<10%

1.工作原理

本试剂盒采用的是生物素双抗体夹心酶联免疫吸附法(ELISA)测定样品中谷氨酸(GLU)的水平。向预先包被了谷氨酸(GLU)单克隆抗体的酶标孔中加入谷氨酸(GLU),加入生物素标记的抗GLU抗体,再与链霉亲和素-HRP结合,形成免疫复合物,再经过温育和洗涤,去除未结合的酶,然后加入底物A、B,产生蓝色,并在酸的作用下转化成***终的黄色。颜色的深浅与样品中谷氨酸(GLU)的浓度呈正相关。

2.试剂盒组成

1

标准品(640μmol/L)

0.5ml

7

显色剂A液

6ml

2

标准品稀释液

3ml

8

显色剂B液

6ml

3

酶标包被板

12孔×8条

9

终止液

6ml

4

链霉亲和素-HRP

6ml

10

说明书

1份

5

30倍浓缩洗涤液

20ml

11

封板膜

2张

6

生物素标记的抗-   GLU抗体

1ml

12

密封袋

1个

 

3.需要而未提供的试剂和器材

1.     37℃恒温箱

2.     标准规格酶标仪

3.     精密移液器及一次性吸头

4.      蒸馏水

5.     一次性试管吸水纸

 

4.样本处理
1.  血清:室温血液自然凝固10-20分钟,离心20分钟左右(2000-3000转/分)。仔细收集上清,保存过程中如出现沉淀,应再次离心。
2.  血浆:应根据标本的要求选择EDTA或柠檬酸钠作为抗凝剂,混合10-20分钟后,离心20分钟左右(2000-3000转/分)。仔细收集上清,保存过程中如有沉淀形成,应再次离心。
3.  尿液:用无菌管收集,离心20分钟左右(2000-3000转/分)。仔细收集上清,保存过程中如有沉淀形成,应再次离心。胸腹水、脑脊液参照实行。
4.  细胞培养上清:检测分泌性的成份时,用无菌管收集。离心20分钟左右(2000-3000转/分)。仔细收集上清。检测细胞内的成份时,用PBS(PH7.2-7.4)稀释细胞悬液,细胞浓度达到100万/ml左右。通过反复冻融,以使细胞破坏并放出细胞内成份。离心20分钟左右(2000-3000转/分)。仔细收集上清。保存过程中如有沉淀形成,应再次离心。
5.  组织标本:切割标本后,称取重量。加入0.02M浓度的PBS(PH7.4)。用液氮迅速冷冻保存备用。标本融化后仍然保持2-8℃的温度。加入一定量的PBS(PH7.4),用手工或匀浆器将标本匀浆充分。离心20分钟左右(2000-3000转/分)。仔细收集上清。分装后一份待检测,其余冷冻备用。

 

5.注意事项

1.从2-8℃取出的试剂盒,在开启试剂盒之前要室温平衡至少30分钟。酶标包被板开封后如未用完,板条应装入密封袋中保存。

2.各步加样均应使用加样器,并经常校对其准确性,以避免试验误差。

3.严格按照说明书的操作进行,试验结果判定必须以酶标仪读数为准。

4.为避免交叉污染,要避免重复使用手中的吸头和封板膜。

5.不用的其它试剂应包装好或盖好。不同批号的试剂不要混用。保质前使用。

6.底物B对光敏感,避免长时间暴露于光下。

 

6.洗板方法

手工洗板方法:甩掉酶标板内的液体;在实验台上铺垫几层吸水纸,酶标板朝下用力拍几次;将稀释后的洗涤液至少0.35ml注入孔内,浸泡1-2分钟。根据需要,重复此过程数次。

自动洗板:如果有自动洗板机,应在熟练使用后再用到正式实验过程中。

 

7.标本要求

1.不能检测含NaN3的样品,因NaN3抑制辣根过氧化物酶的(HRP)活性。

2.标本采集后尽早进行提取,提取按相关文献进行,提取后应尽快进行实验。若不能马上进行试验,可将标本放于-20℃保存,但应避免反复冻融

 

8.操作程序

1.标准品的稀释:(本试剂盒提供原倍标准品一支,用户请按照说明自行在小试管中倍比稀释):

320μmol/L

(5号标准品)

120μl的原倍标准品加入120μl的标准品稀释液

160μmol/L

(4号标准品)

120μl的5号标准品加入120μl的标准品稀释液

80μmol/L

(3号标准品)

120μl的4号标准品加入120μl的标准品稀释液

40μmol/L

(2号标准品)

120μl的3号标准品加入120μl的标准品稀释液

20μmol/L

(1号标准品)

120μl的2号标准品加入120μl的标准品稀释液

2.根据待测样品数量加上标准品的数量决定所需的板条数。每个标准品和空白孔建议做复孔。每个样品根据自己的数量来定,能使用复孔的尽量做复孔。

3.加样:1)空白孔:空白对照孔不加样品,生物素标记的抗GLU抗体,链霉亲和素-HRP,只加显色剂A&B和终止液,其余各步操作相同;2)标准品孔:加入标准品50μl,链霉素-HRP50μl(标准品中已事先整合好生物素抗体,故不加);3)待测样品孔:加入样本40μl,然后各加入抗- GLU抗体10μl、链酶亲和素-HRP50μl,盖上封板膜,轻轻振荡混匀,37℃温育60分钟。

4.配液:将30倍浓缩洗涤液用蒸馏水30倍稀释后备用。

5.洗涤:小心揭掉封板膜,弃去液体,甩干,每孔加满洗涤液,静置30秒后弃去,如此重复5次,拍干。

6.显色:每孔先加入显色剂A 50μl,再加入显色剂B 50μl,轻轻震荡混匀,37℃避光显色10分钟。

7.终止:每孔加终止液50μl,终止反应(此时蓝色立转黄色)。

8.测定:以空白孔调零,450nm波长依序测量各孔的吸光度(OD值)。 测定应在加终止液后10分钟以内进行。

9.根据标准品的浓度及对应的OD值计算出标准曲线的直线回归方程,再根据样品的OD值在回归方程上计算出对应的样品浓度。也可以使用各种应用软件来计算。


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